두경부 편평상피세포암에서 High Mobility Group I 유전자 발현의 임상적 의의에 관한 연구 박준영1 서론 4. HMGI(Y) 단백질 발현과 임상 및 병리학적 소견과의 관계 1)종양의 국소침범정도와 병리적 병기에 따른 HMGI(Y) 단백질 발현과 RT-PCR 원발병소의 병기에 따른 HMGI(Y)단백질은 면역조직화학적 염색에서는 T1: 100%, T2: 94.1%, T3: 90%, T4: 72.7%로 T병기와 연관성이 없었으며, RT-PCR을 이용한 반정량적 분석에서도 T 병기에 따라 각각 2.24±0.49, 2.78±2.57, 3.05±2.56, 3.37±1.68로 연관성이 없었다. 종양의 병리적 병기에서도 HMGI(Y)단백질은 면역조직화학적 염색에서는 1기: 100%, 2기:100%, 3기: 87.5%, 4기: 83.3%로 병리적 병기와 연관성이 없었으며, RT-PCR을 이용한 반정량적 분석 에서도 병리적 병기에 따라 각각 2.59±0.00, 3.38±3.12, 2.83±2.39, 2.93±2.05로 연관성이 없었다. 2) 병리조직학적 분화도에 따른 HMGI(Y)단백질 발현과 RT-PCR HMGI(Y)단백질은 면역조직화학적 염색에서 고도분화군: 90.92%, 중등도분화군: 80%, 저분화군: 100%로 분화도에 따른 양성률의 차이는 없었나, RT-PCR을이용한 반정량적 분석에서 반 정량적 값이 분화도가 좋을수록 통계적으로 의미있게 높았다 (p<0.05,Table 2). HMGI(Y)은 포유류 핵에 존재하는 구조단백질군으로 HMGI,HMGY, HMGI-C로 구성되어있으며 배형성 시기의 세포와 종양세포에서 높은 발현을 보이나, 정상세포에서는 낮은 발현 또는 발현되지 않는 것으로 알려져 있고 대장암, 자궁경부암, 갑상선암등에서 강한 발현 양상을 보이는 것으로 연구되어졌다.  이에 저자들은 면역조직화학적 염색방법과 RT-PCR을 이용하여 HMGI(Y) 단백질의 발현 양상을 관찰하고이 결과를 조직학적 국소침윤, 임상적 병기, 경부림프절 전이 여부, 및 조직학적 분화도와 비교하여 HMGI(Y)단백질이 두경부편평상피세포암에 있어 예후 인자로써의 활용 가능성에 대하여 알아보고자 하였다.    tjf 대상 및 방법 한림대학교 의과대학 강동성심병원에서 원발성 두경부 편평상피세포암으로 수술을 시행받은 환자 총 40례(M:F=32:8, 34세-86세, 평균연령 59.1세)를 대상으로 하였다. 국소 침범정도는 T1(2),T2(17),T3(10),T4(11),병기는 stage I(1),Ⅱ(7),Ⅲ(8). Ⅳ(24),분화도는G1(22), G2 (15),G3(3),그리고 림프절 전이는 20례였다. 포르말린으로 고정 후 파라핀에 포매되어 보존된 종양 조직을 5㎛ 두께로 박절하였다. 통상의 LSAB(DAKO corp.) 면역염색법을 사용했으며 일차 항체로는 HMGI(Y) goat polyclonal antibody를 1:200으로 희석하여 사용하였으며, 반정량적 분석을 위하여 RT-PCR을 이용하였다. 양성대조군은 colon carcinoma로, 음성대조군은 정상구강점막조직으로 하였다. 통계처리는 윈도우형 SPSS 통계 프로그램을 사용하였으며  유의수준은 p< 0.05를 의의 있는 것 으로 하였다.  Table 2. Correlation between expression of HMGI(Y) protein and   pathologic grades    Pathologic grades Number of  positive cases (%)by IHC(n=35)  Semiqauntification  of RT-PCR*(mean±SD)  G1(n=22)  20(90.9%)  3.79 ± 2.39  G2(n=15)  12(80%)  1.93 ± 1.67  G3(n=3)  3(100%)  2.34 ± 1.63  IHC : Immunohistochemistry   G1 : well differentiated, G2 : moderate differentiated, G3 : poorly differentiated  * : p < 0.05    결과 1. HMGI(Y)단백질의 면역조직화학검사   HMGI(Y)단백질의 면역염색은 대부분 핵내에 갈색으로 염색되었다. 두경부암 40례중 35례(87.5%)에서 10%이상의 종양세포 핵에서 발현되었으나 (Fig. 1),양성으로 판명된 두경부 암종의 발현강도는 유사하여 염색의 강도와 비율을 기준으로 정량적으로 나누기는 어려웠다 (Table 1). 대조군 및 종양 주변부 점막은 음성이였고 (Fig. 2)40례 중 5례의암종에서는 편평세포 기저층에 미약하거나 중등도의 양성 반응을 보였으나 HMGI(Y)단백질 양성이었던 두경부 암종보다는 미약한 수준이었다 (p<0.05, Fig. 3).   3) 경부 림프절 전이에 따른 HMGI(Y)단백질 발현과 RT-PCR HMGI(Y)단백질의 면역조직화학적 염색에서 경부림프절 전이가 있던 군은 85%, 전이가없던 군에서는 90%로 유의한 차이가 없었으며, RT-PCR을 이용한 반정량적 분석에서도 전이가 있던 군이 3.32±2.44, 전이가 없던 군이 2.64±2.04로 유의한 차이가 없었다 . 4) 재발에 따른 HMGI(Y)단백질 발현과 RT-PCR 재발은 총 40명중에서 6명에서 재발을 보였으며 HMGI(Y)단백질의 면역조직화학적 염색에서는 재발한 경우: 100%, 재발하지 않은 경우: 85.2%로 재발한 경우 발현이 더 잘되었으나 통계적 유의성은 없었다. 그러나 RT-PCR을 이용한 반정량적 분석에서는 재발한 경우: 5.04±3.09, 재발하지 않은 경우: 2.62±1.89로 재발한 경우 반정량적 값이 높았으며 통계적으로도 유의하였다 (P<0.05,Table 3). Fig.1 Fig.2 Fig.3 Table 3. Correlation between expression of HMGI(Y) protein and  recurrence   Recurrence  Number of  positive cases (%)by IHC(n=35)  Semiqauntification  of RT-PCR *(mean±SD)  Yes(n=6)  6 (100%)  5.04 ± 3.09  No (n=34)  29 (85.3%)  2.62 ± 1.89       IHC : Immunohistochemistry  * : p < 0.05  Table 1. HMGI(Y) protein expression of normal mucosa and  cancer tissue  Method Number of  positive cases (%) by IHC* Semiqauntification of RT-PCR*  (mean±SD)  Normal tissue 0/10(0%) 0.47 ± 0.25  Carcinoma 35/40(87.5%) 2.98 ± 2.24  IHC : Immunohistochemistry          * : p<0.05  결론 두경부 편평세포암에서 HMGI(Y) 유전자의 발현은 정상 점막조직에 비하여 현격한 HMGI(Y) 발현 의 차이를 보였다. 이는 면역조직화학 검사뿐 아니라 역전사 중합효소연쇄 반응에서도 동일한 결과를 관찰할 수 있었다. 면역조직학적염색에서 HMGI(Y)의 발현은 암의 병리학적 분화도와 예후를반영하는 인자 즉 원발부위 병기, 병리적 병기, 림프절 전이나 종양의 재발여부 상관관계가 없었다. RT-PCR을 이용한 HMGI(Y) mRNNA의 반정량적 분석은 종양의 원발부위 병기, 병리적 병기나 림프절 전이와는 상관관계가 없었으나, 종양의 분화도가 고분화도일수록 유의하게 높은 값을 나타내었고 재발한 경우에 도 유의하게 높은 값을 나타내었다. 그리고 정상 점막과 종양주변의 정상 두경부 편평상피 조직은 대부 분 음성이거나 미약한 염색을 보여 암종과는 현저한 차이를 보였다. 본 연구의 결과로는 세포의 분화도 에 따라서는 분화가 발달된 군에서 더욱 강한 발현을 보였고 치료후의 재발한 군에서 역시 발현율이 높 아 통상적인 분화가 나쁜 세포에서 예후가 불량하다는 개념과는 상이한 결과를 보여 이에 대한 보다 구 체적인 연구가 필요하다고 생각된다 . 결론적으로 HMGI(Y)유전자는 두경부 편평세포암의 발생 및 진행에 있어서 어떤 형식으로든 관여함을 의미 한다고 볼 수 있으며, 향후 두경부 편평세포암의 표식자로서 활용가치가 있다고 생각된다. 하지만 두경부 편평세포암의 악성도를 나타내는 예후인자로서의 가치에 대해서는 향 후 지속적인 연구가 필요하다고 사료된다. 참 고 문 헌 1. Bandiera A, Bonifacio D, Manfiloletti G, Mantovani F, Rustighi A, Zanconati F, Fusco A, Di Bontio L & Giancotti V, Expression of HMGI(Y) proteins in squamous intraepithlial and invasive lesions of the uterine cervix, Cancer Res, 5 : 426-431, 1998 2. Chiappeta G, Bandiera A, Berlingieri MT, Visconti R, Manifioletti F, Battista A, Martinez-Tello FJ, Santoro M, Giancotti V & Fusco A, The expression of the high mobility group HMGI(Y) proteins correlates with the malignant phenotype of human thyroid neoplasias, Oncogene, 10 : 1307-1314, 1995 3. Chiappeta G, Tallini MC, De Biasio G, Manfioletti F, Martinez-Tello FJ & Pentimalli F, Detection of high mobility group HMGI(Y) proteins in the diagnosis thyroid tumors : HMGI(Y) expression represents a potenial diagnostic indicator of carcinoma, Cancer Res, 58 : 4193-4198, 1998 4. Fedele M, Bandiera A, Chiappetta G, Battista S, Viglietto G, Manfioletti G, Casamassimi A, Santoro M, Giancotti V & Fuso A, Human colorectal carcinomas express high levels of high mobility group HMGI(Y) proteins, Camcer Res, 56 : 1986-1901, 1996 2. 정상 점막과 암세포에서의 역전사 중합효소 연쇄반응에 의한 HMGI(Y)단백질의 발현   HMGI(Y)단백질 RT-PCR의 반정량은 β-actin과의 상대적 band의 강도로 구하였는데 두경부 암종에서 평균은 2.98±2.24이었고, 정상조직에서의 평균은 0.47±0.25로 두경부 암종과 정상조직사이에 현격한 HMGI(Y)단백질 발현의 차이를 보여 주었다 (p<0.001)(Table1). HMGI(Y)단백질 양성인 검체 에서 RT-PCR로 확인된 신호강도는 164 염기의 크기였으며, 양성으로 나온 두경부암종 조직중 무작위로 추출한 5예의 DNA 서열검사에서 HMGI(Y) cDNA (gene bank accession no., M90100)의 염기서열과 동일하였다(Fig. 4).   Fig.4 HMGI(Y) expression in normal mucosa(N1-3),positive control (C) and squamous cell carcinoma of head and neck (T1-10) by RT-PCR. 164bp : HMGI(Y)  154bp : β-actin    3. HMGI(Y)단백질의 면역조직화학검사와 역전사 중합효소 연쇄반응에 의한 발현과의 관계  면역조직화학검사에서 HMGI(Y)단백질 발현이 음성인 5례에서 역전사 중합효소 연쇄반응에 의한반정량적 값의 평균은 2.52±1.52였고, 양성인 35례에서 역전사 중합효소 연쇄반응에 의한 반정량적 값의 평균은 3.05±2.34였지만 통계적 유의성은 없었다.