6장 대사산물의 생산 - 6-1. 유기산발효 - 6-2. 알코올발효 - 6-3. 유기용매발효 - 6-4. 아미노산발효 - 6-5. 핵산발효 - 6-6. 항생물질 - 6-7. 생리활성물질 - 6-8. 고분자물질발효 - 6-9. 효소 5강

6-8. 생물 고분자물질 발효 - 생물고분자(Biopolymer) : 생체에서 유도된 모든 고분자물질   : 생체에서 유도된 모든 고분자물질  생물학적으로 합성되고 분해 - 다당류, 고분자유기산, 고분자 펩타이드, 단백질, 핵산 등 - 생물학적인 고찰    대부분의 미생물/미세조류  다당류 생산(세포내/외)    외부로부터 자신을 보호할 목적      에너지원/충격완화/고착/건조방지 등      원생동물/bacterophage/병원성세균 항체보호/감염기작의 신호물질    다양한 화합물과 결합 (다가양이온, 단백질, 생합성물질, 무기염류 등)      황함유다당류        : 항바이러스 효과        : 황이온의 음전하 +바이러스의 표면의 양전하 = 바이러스의 침입을 방해          : 역전사효소활성저해(HIV)         다가 양이온성 다당        : interferon의 생성을 촉진            예) 헤파린(종양형성억제, 항응고제)

- 산업적 관심   : 세포외 분비성 다당류      수용성, 무독성의 특징      식품, 의약품, 화장품 등의 점도조절제, 유화안정제, 표면장력조절, 점착능, 윤활능, 필름형성능, 현탁제, 수분조절제 등에 응용      ○ 식품 : 식품의 가공/보존을 위한 첨가제      ○ 농업분야 : 토양보수, 육모용 종자, 식물재배용 배지를 위한 고형제      ○ 화장품 : 보습, 피부개선을 위한 기능성 첨가물      ○ 의학분야 : 렌즈, 인공관절, 피부피복제, 생리활성제, 약물전달체, 대용혈청재제 등      ○ 산업적 : 섬유, 필름, 종이, 페인트, 인크 등 첨가제      ○ 화학공학분야 : 물질분리, 농축소재 등      ○ 반도체분야 : 집적회로의 광저항성 및 초전도복합소재   - 현재 연구된 종류(표 6-37)   : 미생물 세포내 에너지 저장물질로 축척(polyester)되는 bioplastics

1. Xanthan gum - 생산균주 : Xanthanomonase campestris 등 - 조성 : Glucose, mannose, glucuronic acid, acetate, pyruvate로 구성된 반복구조         : pyruvate 단위의 수와 분자량 (점도에 영향을 미침) - 공업적 제조     탄소원 : 포도당, 설탕, 옥수수전분 가수분해물 2~4%     질소원 : Yeast extract, peptone, NH4NO3, 요소 0.05~0.1%     무기염류 및 생육인자     pH 7.0     2일 배양 후 점도증가가 뚜렷한 나타난다. - 정제      배양액(드럼건조기, 분무건조기) → 분말화     식품용 : 200 cps로 희석 → 여과/원심분리 → 균체제거 → methanol 또는 isopropanol로 침전 → 건조 → 분말화 cps: centipoise = cP, 1cps = 1g/(cm s)

- 용도    1) 식품 : 점도증가 또는 켈형성을 위한 아이스크림, 밀크쉐이크, 피자소스, 인스턴트스프, 냉동식품, 가공치즈, 통조림 등            : 0.05~0.5%로 첨가    2) 공업용 : 석유체취, 법랑제품, 페인트, 화장품, 의약품 등 광범위하게 이용

2. Curdlan - Alcaligenes faecalis var myxogenes - β-1,3 glucan    → Succinoglucan의 구성 : glucose, 10% succinic acid, galactose    → Curdlan의 구성 : β-1,3 glycoside 결합 - 배양    → 8% glucose 배지에서 80시간배양 40g/L 수율    → 불용성으로 배양기간 동안 점성이 증가하지 않음 - 물을 20배 배유할 수 있으며    → 가열시 54~60℃에서 녹아 투명    →        80℃이상 : 겔 강도 증가 - 용도 : 켈 여과, 담체, 친화성크로마토그래피용, 식품용겔화제 등 이용

3. Pullulan - 생성균주 : Aureobasidium pullulans    → α-1,4와 수개의 α-1,6 glycoside 결합 → glucan - 기질과 배양조건에 의존    → 수율과 분자량 5x104 ~4x106  - 배양    → 전분, glucose, 설탕을 탄소원       : 배양 (pH 5~6, 7일) → 1.5~4x106 고분자량              (pH 7~8, 7일 ) → 5~10x104 저분자량    → 전분가수분해물을 10%함유한 탄소원       : 75%수율을 얻음    - 용도    → 수용성, 체내효소에 의해 소화되지 않음    → 저칼로리 식품원료로 이용    → 접착제, 산화방지용 포장재로 식품, 화장품, 의약품에 이용

4. Scleroglucan (스클로글루칸) - 생산균주 : Sclerotium glucanicum, S. delphinii, S. rodfsii, S. libertiana, Helotium sp. - 구조 : β-6,1 결합을 측쇄로하고 β-1,3 결합으로 형성된 glucan          : 세포외에 축척, 중성다당류    - 용도 : 수용성, 점착성, 고온 및 광범위 pH에서 pseudoplastic의 성질       : 식품의 코팅제, 젤 화제

5. dextran - 균주 : Leuconostoc mesenteroide L. dextranium - 배양 : 설탕을 탄소원으로 하여 배양      : dextransucrase를 사용하기도 함 - 혈장증량제로 활용

6. Cyclodextrin (CD) - 전분 + Cyclodextrin glucanotransferase(CGTase) 작용     : α-1,4 결합으로 이루어진 환상구조 화합물을 형성 - 구조   → Glucose 6개 결합 : α-CD   → Glucose 7개 결합 : β-CD    → Glucose 8개 결합 : γ-CD  - CGTase 생산균주   → Bacillus macerans, B. megaterium, B. circulans, B. stearothermophillus      Klebsiella pneumoniae 등

- CD 생성과정 그림 6.55 - 용도     → 환상구조의 내부-소수성, 외부-친수성    → 소수성 화합물이 내부에 포접되어 안정한 화합물을 형성    → 휘발성물질의 안정화, 산화 및 광분해물질의 보호, 물리화학적 성질의 변화       화학반응성 변화, 난용성물질의 유화, 분말화 등의 기능    → 식품, 화장품, 의약품, 농약 등에 적용    → 물에 잘 녹지 않아 포도당, 맥아당을 이용 분지 CD를 만들어  수용성을 증가

7. Alginate - D-mannuronic acid, L-guluronic acid로 구성(β-1,4) - Azotobater vinelandii : uronic acid의 비율을 조절 - 해조류의 것과는 차이 - 식품용으로 대부분 이용되고 있으며 일부 제지공업에서 이용    8. Hyaluronic acid (히알루론산) - D-glucuronic acid, N-acetyl glucosamine이 상호결합 - 직쇄상의 무색 투명한 고점도 다당체 저분자물질(화장품), 고분자물질(의약품)  세균/독극물의 침입을 제어 9. Levan - Bacillus 속, Streptococcus 속 - 분자량 5,000 정도로 선상의 fructan(β-2,6) - B. polymyxa 로부터 설탕을 기질로 배양 - 용도 : 대용혈액

6.8.2 플라스틱성 생물고분자 - 생체합성, 생분해 특성으로 수술봉합체로 사용 - 인공심장, 인공신장, 인공수정체 등의 의료용으로 사용가능성이 높음 - 포장용 필름 대체소재 - PHB(poly-β-hydroxybutyrate), 유사체인 PHA(poly-β-hydroxyalkanoate) 계열의 polyester와 polyactide 등 - Alcaligenes eutrophus  PHB/PHV의 공중합체(Copolymer)를 생산 - A. eutrophus   → propionic acid + pentanoicacid를 탄소원 → 3HB와 3HV 공중합체   → butyric acid를 탄소원 → 3HB, 4HB 공중합체 - Protomonas extorquens   → 메탄올을 이용 → 건조중량 60%의 PHB 생산   → 유가배양법 → 160g/L - Methylobacterium organophilum   → 질소와 칼륨을 결핍 → 58% PHB를 생산

6-9. 효소 - 미생물  여러 종류의 효소를 생산 - 효소의 산업적 적용 1898년 Takamine  A. oryzae를 이용 Takadiastase를 소화효소로 생산 - 미생물을 이용한 효소생산의 장점 → 동식물에 비하여 계절적인 영향을 받지 않음 → 미생물육종을 통하여 짧은 시간내에 대량배양이 가능 → 제조원가가 저렴하고 다양한 종류를 생산할 수 있음. - 효소생산공정의 개발 → 고정화 기술(효소의 안전성/연속사용) → 유전자조작기술과 단백질공학기술의 발달로 효소의 생산성과 안정성이 증대 → 다양화와 대규모화가 가능 - 적용분야 → 식품, 피혁, 섬유, 의약품, 화장품, 세제, 바이오센서, 공해처리, 연료전지 등 이용성 증대

고정화효소 - 효소의 고정화 : 3가지가 이용 1) 담체결합법 : 물에 불용성인 담체에 효소를 결합하는 방법 - 공유결합, 이온결합, 물리적 흡착 2) 가교법 : 효소를 두 가지 이상의 관능기를 가진 시약과 반응하여 가교하는 방법 3) 포괄법 : 효소를 겔의 미세한 격자속에 포괄하거나 반투과성 고부자 피막으로 둘러싸는 방법 - 격자형, 마이크로캡슐형

1. Amylase - 전분을 구성하는 amylose(α-1,4 결합된 포도당), amylopectin(α-1,4와 α-1,6 의 가지형 복합체), glycogen 등    → α-1,4 glucoside 결합 또는 α-1,6결합을 가수분해하는 효소 - α-amylase, β-amylase, glucoamylase, pullulanase 등 가. α-amylase  - 전분의 α-1,4 glucoside 결합을 분해(endo)하나 α-1,6결합은 작용하지 않음  포도당, 엿당, matotriose 생성 - 전분의 점도 감소 →dextrin, maltose, glucose - 타액, 취액, 맥아 등에 존재 - Bacillus subtilis 등 세균과 Aspergillus 속 곰팡이등에 많이 존재

 1) 세균 amylase - Bacillus subtilis, B. mesentericus, B. amyloliquefaciens 등 - 배지    → 대두박 5%, 전분 1.5%, (NH4)2HPO4 1.2%, KCl 0.01%, MgSO47H2O 0.01%, pH 7.0    → 35~37℃ 통기교반배양 - 정제: CaCl2+규조토 → 청징여과액(Ca amylase의 내열성을 증가 그 외 Na, Cl) - 최적 pH 5.8~6.4 - 호발제, 술덧의 액화, 물엿이나 포도당의 제조에서  전분의 고온액화(83~88℃)에 이용   2) 곰팡이 amylase - Aspergillus oryzae    → 전분 8%, NaNO3 1.2%, K2HPO4 0.1%, MgSO47H2O 0.1%, KCl 0.05%, FeSO4 0.03% Mg(NO3)2 0.08%, Mg(H2PO4)2 0.05% malt extract 2%    → 28~30℃, 3~4일배양 - A. niger (내산성 amylase, pH 2.0)

나) β-amylase - 전분의 α-1,4 결합을 비환원성 말단으로부터 β-maltose를 생성    → α-1,6 결합의 분기점에서 정지    → 다량의 맥아당과 β-limite dextrin 생성    → 환원당 증가, 점도저하가 뚜렷하지 않음, 요오드반응시 적갈색 - 고구마, 맥아, 소맥, 대두에 존재 - Bacillus polymyxa, B. cereus, B. megaterium, Streptomyces pracus - 세균성 β-amylase는 식물성보다 내열성이 높음(70℃) - 최적 pH 7.0 - 안정화에 Ca 가 필요치 않음 나. Glucoamylase - 전분의 비활성 말단 → 포도당단위로 α-1,4결합을 차례로 분해                        → β-1,6도 분해 - A. niger, A. oryzae, A. awamori, Rhizopus delemar 등     A. niger : 전분을 70~80%을 분해  Rhizopus delemar: 전분을 100%분해 - 최근 열에 안정한 세균을 이용하여 생산성을 개선

다. Isoamylase (Pullulanse, R 효소) - Amylopectin, glycogen 의 α-1,6 결합을 특이적으로 분해     직쇄의 dextrin을 생성 - 요오드반응 : 적자색 → 청색으로 변화 - 효모에서 처음발견, 식물의 효소(R-enzyme라 칭함) - Aerobacter aerogenes : pullulane에 작용(α-1,6을 절단)

라. Cyclodextrin glycosyltransferase(CGTase, Bacillus macerans의 amylase) - 전분에 작용하여 α-1,4 결합을 분해     → 6~8개의 CD를 생성(Cyclization)    → 새로운 α-1,4결합을 가지는 CD를 만드는 일종의 전이효소 - 전분이외의 당 수용체(A)가 존재시     → 전이반응에 의해 CD가 개열하여    → A를 4위탄소 -OH에 전이시켜 α-1,4결합을 유도(Coupling)  개환 - 직쇄의 oligo 당간의 불균질화 반응을 촉매(Disproportionation) - 효소의 개환반응을 이용 새로운 당전이 제품을 개발

마. Cellulase - Cellulose의 β-1,4 결합을 가수분해 - 3종의 복합체를 형성하여 작용  endo-β-1,4-glucanse(EG: Cx-효소)    exo-β-1,4-glucanse(cellobiohydrolase; CBH:C1효소)     β-glucosidase(Cellobiase)   - 수용성 cellulose 인 CMC를 가수분해하는 효소: CMCase (Cx 효소)    Cellulose을 분해하는 효소 C1효소(단독으로 작용하지 못함) - 균주 : Tricoderma viride, A. niger, Irpex lacteus, Fusarium moniliform 등 - Cellulase 제제     hemicellulose, pectinase, protease가 복합체로 되어 있음 - 응용  전분제조, 대두단백추출, 해조류로부터 한천의 추출, 곡류 및 두류의 탈피, 소화제, 사료가공 등에 이용 바. hemicellulase - hemicellulose 식물의 세포벽에 존재, 알카리로 추출되는 다당류의 총칭 - 이를 분해하는 효소 hemicellulase     → xylanase, galactanase, mannase, arabinose 4종으로 분류 - 공업적으로는 hemicellulase 제제는 없고 다른 효소에 함유

Exo – type Exo – type

Invertase (β-fructofuranosidase, 1940년대 개발, ) - sucrose = glucose + fructose  가수분해하는 효소    → fructose 측면에서 절단하는 β-fructosidase (Saccharomyces cerevisiae)    → glucose 측면에서 절단하는 α-glucosidase - 식품공업에서는 전자를 이용 - 설탕을 분해한 전화당은 설탕보다 용해도가 높고 당의 결정석출을 방지이며                           식품의 수분을 유지 - 적용 : 초콜릿, 양갱, 아이스크림, 인공벌꿀제조에 이용 Lactase (β-galactosidase) - Lactose = glucose + galactose (가수분해) A. niger, A. oryzae, Kluyeromyces marxianus, S. fragilis, S. lactis, C. spherica, C. pseudotropicalis 효모가 생성하는 효소의 최적 pH 6~7(cellulose acetate fiber에 고정) Aspergillus 속 이 생성하는 최적 pH 3~4(silica에 고정)  유청의 처리에 유용 - 응용: 빵의 개량, 저유당유의 제조, 아이스크림에서 유당결정을 감소

Melibiase(α-galactosidase) - Meliviose, Raffinose, starchyose 당류에서 α-D-galactoside를 가수분해 - Mortiella vinacea - 제당공업에서 설탕의 결정화를 방해하는    → raffinose  설탕과 galactose로 분해 → 설탕 수율을 향상 Naringinase - 쓴맛이 강한 감귤류에서 쓴맛의 주원료인 naringin - Naringinase에 의해 rhamnose + glucose의 α-1,2결합을 가수분해      rhamnose + naringenin-7-glucoside                  galactosidase에 의해 glucose + naringenin 분해 - A. niger, A. oryzae, Coniothyrium diplodiella 등

Hesperisinase - Hesperidin은 밀감류에 함유되어 있는 비타민 P 군 - 과즙과 통조림 제조시 백탁의 원인 - Hesperisinase 에 의해 백탁을 방지 - 최적 pH 3.5, 최적온도 60℃, 안정 3.0~8.5

Protease 가) 종류 - 최적 pH에 의한 분류     산성, 중성, 알카리성 - 작용위치     endopeptidase : 중간에 작용 두개의 pepetide를 생성, proteinase라함     exopeptidase : 말단의 아미노기(aminopeptidase) 또는 카복실기 (Carboxypeptidase)에 작용             : dipeptidase는 dipeptide에 만 작용 - 활성양식     serine protease : serine 잔기가 효소활성에 관여     thiol protease : thiolrl(SH기)가 효소활성에 관여     금속 protease : 효소활성에 작용하는 금속을 함유

  나) 미생물 단백질분해효소   - 곰팡이 단백질분해효소     → 산성, 중성, 알카리성 분류     → A. oryzae : 3종을 모두 생성, 배지의 pH에 따라 생성     → A. niger, saitoi, awamori 등 내산성의 산성 protease 생성   - 세균 단백질분해효소     → B. subtilis : 생성되는 protease를 subtilisin라 함                   (중성과 알카리성)   - 방선균 단백질분해효소     → S. griseus : 단백질분해효소는 최적 pH 7~8, Ca에 안정, 소염작용   - 적용     → 제과, 제빵, 고기의 연화, 수산가공, 조미료의 제조,        청주-맥주의 혼탁제거, 된장-간장의 소양제조, 소화제, 피혁가공,        세제, 소염제 등에 활용

- Mucor pusillus Lindt, Endothia parasitica 등 Pectinase - 고등식물에 널리 분포 미생물 응유효소   - 단백질을 응고시키는 작용   - 치즈제조시 사용   - Mucor pusillus Lindt, Endothia parasitica 등 Pectinase   - 고등식물에 널리 분포   - 식물조직의 것은 냉수에서는 불용성, 온수에서 가용성 (protopectin)     - pectin의 구성(그림 6-65)   - pectinase (3종의 효소가 상호작용)     → protopectinase : 불용성의 천연 pectin을 가용성 pectin     → pectin esterase : methyl ester를 분해 (pectinic acid)     → polygalacturinase : α-1,4 결합을 가수분해 (endo, exo-form) D-galacturonic acid α-1-4 결합

  - pectinase (3종의 효소가 상호작용)     → protopectinase : 불용성의 천연 pectin을 가용성 pectin     → pectin esterase : methyl ester를 분해 (pectinic acid)     → polygalacturinase : α-1,4 결합을 가수분해 (endo, exo-form)   - Aspergillus niger, wentii, saitoi 등   - 적용     → 과즙의 청징제, 착즙시 수득량 증가에 이용, 젤리제조에 이용 Lipase   - 중성지방을 지방산과 glycerin으로 가수분해   - A. niger, Candida cylindeacea 등   - 반응속도     → 기질과 물의 계면의 면적에 지배     → 소화제, 세제, 지방산제조, 유제품에 작용     → 우유에 지방산함량을 증가 유제품의 방향을 풍부하게 하는 효과

Glucose oxidase Glucose isomerase Catalase   - glucose를 산화 → glucono-δ-lactone(→gluconic acid)과 H2O2를 생성   - A. niger, Penicillium natatum   - 최적 pH 5.6~5.8, 온도 30~40도   - Glucose와 산소를 제거    → 계란분말제조, 과즙, 맥주, 청주, 기타 산화에 의한 식품의 갈변방지에 이용   Glucose isomerase   - D-glucose → D-fractose로 이성화하는 효소   - 감미도가 낮은 포도당시럽에서 감미도가 높은 과당시럽을 제조  초기 전환율 40~50%  잔류포도당을 이용하여 재반을 시킬 경우 80%까지 전환   - Bacillus coagulans, S. albus, S. boblilae 등   - 제과, 제빵, 통조림용 시럽 등 Catalase   - 과산화수소를 분해하는 기능     → 과산화수소 존재시 알코올이난 개미산 등의 산화를 촉매하는 효소   - Micrococcus lysodeikticus, Pse. spheroides 등   - 우유, 치즈, 어묵의 살균에 과산화수소를 이용     → 저장성 증대     → 잔존하는 과산화수소를 분해

Tannase Penicillinase - Tannin의 ester 결합이나 depside 결합을 분해   - A. niger, A flavus, Penicillium glaucum 등   - 홍차나 맥주의 혼탁방지    Penicillinase   - 페니실린의 β-lactam 환을 파괴   - 페니실린이 함유된 젖소의 우유는 치즈제조시 starter의 발육을 저해     →페닌실린을 분해   - B. cereus, B. subtilis 등