창해 연구소 수습 사원 강 현 우

Introduction 시대적 상황 Zymomonas mobilis ; 재생 불가한 에너지 자원의 고갈과 이용에 따라 환경에 대한 관심이 고조 또한 연료의 가격 상승과 국제 오일 시장의 불안정 ->에탄올과 같은 대체에너지의 대량생산을 위한 발효 공정의 이용에 대한 관심이 증대 ; Z. mobilis 와 같은 에탄올 생산 미생물이 연료용 에탄올 생산을 위한 잠재성을 가짐. Zymomonas mobilis ; Z. mobilis 는 열대지방에서 용설란주, 야자수 와인 생산을 위해 사용 Glucose대사를 위해 ED(Entner-Doudoroff) pathway를 사용- 1mol ATP/1mol glucose - 장점 : (i) its high and specific rates of sugar uptake and ethanol production (ii) its production of ethanol at yields close to the theoretical maximum with relatively low biomass formation, (iii) its high ethanol tolerance of up to 16% (vol/vol) (iv) its facility for genetic manipulation

Introduction 최근 연구 동향 그러나, Z. mobilis 야생 균주는 탄소원으로 glucose, sucrose, fructose 만 이용. 그래서 최근 연구는 pentose sugars(ribose,arabinose,xylose) 를 사용할 수 있는 균주 개발에 초점이 맞춰짐 값싼 lignocellulosic hydrolysates를 에탄올로 전환하려는 노력의 일환 -> 여러 mutants나 균주 개량을 위한 metabolic flux analysis의 적용, site directed- mutagenesis, gene deletion, insertion, metabolic engineering 등은 이미 여러 차례 보고된 바 있다. 그리고, Z.mobilis ZM4 유전체와 ribosomal transcriptional unit 의 physical map은 이미 보고 이 논문에서는 Z. mobilis ZM4 genome의 전체 염기서열을 Z. mobilis ZM1과 비교하여 ZM4의 유전적인 특성들을 서술.

Introduction Improved mutants Strain development 9. Zaldivar, J., Nielsen, J. & Olsson, J. Fuel ethanol production from lignocellulose:a challenge for metabolic engineering and process integration. Appl. Microbiol.Biotechnol. 56, 17–34 (2001). 10. Ingram, L.O. et al. Enteric bacterial catalysts for fuel ethanol production. Biotechnol. Prog. 15, 855–866 (1999). 11. Ingram, L.O. et al. Metabolic engineering of bacteria for ethanol production. Biotechnol. Bioeng. 58, 204–214 (1998). Strain development 12.Hatzimanikatis, V., Emmerling, M., Sauer, U. & Bailey, J.E. Application of mathematical tools for metabolic design of microbial ethanol production. Biotechnol. Bioeng. 58, 154–161 (1998). 13. Cornish-Bowden, A. & Cardenas, M.L. From genome to cellular phenotype–a role for metabolic flux analysis Nat. Biotechnol. 18, 267–268 (2000). Physical map of Z. mobilis ZM4 genome and the ribosomal transcriptional unit 14. Kang, H.L. & Kang, H.S. A physical map of the genome of ethanol fermentative bacterium Zymomonas mobilis ZM4 and localization of genes on the map. Gene 206, 223–228 (1998). 15. Lee, J.S., Jin, S.J. & Kang, H.S. Molecular organization of the ribosomal RNA transcription unit and the phylogenetic study of Zymomonas mobilis ZM4. Mol. Cells 11, 68–74 (2001).

Results General features

General features

Supplementary Table 1. … 1998개의 ORF (27 page에 해당)

Replication origin predicted by calculating GC skew(G–C/G+C) values closely coincided with a 656-bp region containing one copy of a likely site (5’-GATCTNTTNTTTT-3’) for initial DNA unwinding, And eight copies of probable sites (5’-TTATNCANA-3’) for DnaA binding.

Comparison with other sequenced genomes Z. mobilis ZM4 ORFs (amino acid sequences) 를 다른 보고된 유전체들과 비교하였을 때, 1,668 ORFs 중에서 768개가 Novosphingobium aromaticivorans 에 상응하는 ORFs와 가장 큰 유사성을 갖는다. - Z. mobilis ZM4의 16S ribosomal RNA sequence에 대한 연구를 보면 Sphingomonas spp. group에 속한다는 것을 보여준다. 특히, the ORFs classified into COG category J (translation, ribosomal structure and biogenesis) 와 category D (cell division and chromosome partitioning)는 N. aromaticivorans 에 가장 높은 유사성을 보임 대조적으로, 전체 40 ORFs classified into the COG category N (cell motility) 중 2개만이, 그리고 전체 25 ORFs in category V (defense mechanisms) 중에서 5개만이 N. aromaticivorans ORFs와 연관성을 보인다.

General metabolism Z. mobilis는 ED pathway를 통해서 glucose, fructose, sucrose 를 혐기적 조건에서 대사하여 ethanol 과 CO2를 생산한다. Hexose-metabolizing enzymes such as invertase (ZMO0375,ZMO0942), levansucrase (ZMO0374), glucokinase (ZMO0369), glucose-6-phosphate isomerase (ZMO1212) and glucose-fructose oxidoreductase (ZMO0689) ; Z. mobilis 가 sucrose, fructose and glucose 뿐 아니라 mannose, raffinose, sorbitol 도 이용 그러나 lactose, maltose or cellobiose를 사용하는데 관여하는 유전자들은 발견되지 않음. glucose-6-phosphate dehydrogenase (zwf, ZMO0367) lactonase (ZMO1478). 6-phosphogluconate 6-phosphogluconate dehydratase(edd, ZMO0368) KDPG aldolase (eda, ZMO0997)- pyruvate and glyceraldehyde-3-phosphate Glyceraldehyde-3-phosphate - Embden-Meyerhof-Parnass (EMP) pathway를 통해 에탄올과 이산화탄소 생산.

General metabolism 2-oxoglutarate dehydrogenase complex, malate dehydrogenase 는 발견되지 않음 그러나, oxaloacetate, malate, fumarate, succinate는 HPLC분석결과 검출되었고, Z. mobilis 는 lysine 과 methionine을 제외한 모든 essential amino acids을 합성하는 것으로 알려짐. =>이는 oxaloacetate, malate, fumarate, succinate를 합성하는 다른 대사과정이 존재 그러나, succinate production을 위한 pathway,즉, glyoxylate cycle과 같은 것은 발견되지 않음. (ZMO1496) (ZMO1955). citrate lyase (ZMO0487) fumarate dehydratase (ZMO1307).

Higher G+C-content genes found only in strain ZM4 -To compare the Z. mobilis ZM4 genome with the unsequenced type strain (ZM1: ATCC10988) of Z. mobilis ZM1 과 ZM4 의 전반적인 genome structure 는 매우 유사. 그러나, ZM1에는 없이 ZM4에 존재하는 여러 유전자에 대한 것들은 흥미로움. 이러한 염기서열은 다섯 개의 지역에서 각각 Cluster형태로 총 54개의 유전자가 발견.

54 ORFs 중에서는 - 4 membrane transport proteins, - 4 proteins involved in a type IV secretory system, - an oxidoreductase related to short chain alcohol dehydrogenase - several transcriptional regulators

… … Supplementary Table 3. Supplementary Table 4. 294 ORFs were upregulated more than twofold in ZM4 153 ORFs were expressed more than twice in ZM1 … …

Discussion Z. mobilis ZM4의 전체 유전체에 대한 분석 - 이 균주가 에탄올 생산을 위한 훌륭한 균주 중 하나인 이유와 에탄올 생산 속도와 수율을 향상시킬 수 있는 가능성 시사. Z. mobilis 는 ED pathway를 사용하여 1 mole ATP/ 1 mole glucose를 생산하기 때문에 균체 이용률이 낮고, pyruvate decarboxylase 와 alcohol dehydrogenase가 고발현됨은 포도당의 높은 이용률과 에탄올 생산성에 대한 뒷바침 TCA cycle에서 2-oxoglutarate dehydrogenase complex 와 malate dehydrogenase의 부재는 다른 pathway의 존재를 의미- TCA cycle이 세포성장에 필수적인 대사산물을 만들어내므로 이는 TCA cycle이 활성화된 다른 미생물에 비해 적은 균체 형성에 대한 설명을 제공 추가된 54개의 ORF들 중에서 transport proteins 와 permeases를 암호화하는 4개의 ORF들과 NAD(P)H:quinone oxidoreductase(ZMO1949),oxidoreductase (short-chain alcohol dehydrogenases; ZMO1946) 를 위한 2개의 유전자 는 매우 고효율로 발현됨 – 포도당 이용과 에탄올 생산의 고효율성 capsular carbohydrate synthesis enzymes를 암호화하는 두개의 유전자 또한 발현이 활성화 - 고농도의 포도당과 발효하는 동안 생산되는 에탄올에 대한 삼투압에 대한 저항성