HLA 교차시험 ( HLA crossmatch)
HLA (Human Leukocyte Antigen) ▶ 사람의 MHC에서 생성되는 분자 ▶ HLA의 다형성 ▶ HLA 분자내 항원 결합부위/T 세포 항원 수용체 인식부위에 밀접
HLA 유전자 ▶사람의 제 6번 염색체의 단완부에 위치 ▶유전 haplotype (일체배형): 동일 염색체에 부모 자식간에는 50% 유사 형제 자매간 일치 확률은 25%
HLA 형별 검사 이용 ▶ 장기이식: 적절한 장기 공여자 선정 ▶ 질병진단: 강직성 척추염 류마티스 관절염 ▶ 법의학적: 친자감별, 개인식별 ▶ 기타 HLA 관련 연구
Crossmatch 원리 ▶ 미세림프구 독성 검사 ( microlymphocytotoxicity)
Crossmatch 목적 ▶ 초급성 거부반응의 예방 ▶ 장기의 생존 예측 ▶ 장기이식 전 HLA 항체 존재 유무
Crossmatch 채혈량 ▶ 환자(Recipient) ACD tube 10ml + plain tube 3ml ▶ 공여자(Doner) ACD tube 30ml + plain tube 3ml
Crossmatch 검사 준비 ▶ 대조혈청 (control) ▶ 환자의 T cell ▶ 공여자의 T cell, B cell ▶ 환자와 공여자의 희석 혈청 (diliuted serum)
환자, 공여자의 림프구 분리 ▶ 원리: 밀도구배법 ▶ 검사에 맞는 세포 상태 림프구 순도: 80% 이상 세포수: 2,000~3,000/L 생존율: 80% 이상
공여자의 T cell, B cell 분리 ▶ T cell 분리: B 림프구와 단구의 nylon 흡착 성질을 이용하여 분리된 단핵구를 nylon wool column에 넣어 37℃ water bath 안에 있던 5% FBS-RPMI로 씻어낸다. ▶ B cell 분리: 냉장 보관되어 있던 15% FBS-RPMI로 물리적인 충격을 주며 column을 씻어낸다.
Microplate 분주 1 2 3 4 5 6 혈청희석 배수 1:1 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 환자/ 공여자 대조 혈청희석 배수 1:1 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 환자/ 공여자 대조 환자cell + ABS + 5%FBS- RPMI 공여자cell + ABS Anti-CD3 + 공여자 cell Anti-CD19 + 공여자 cell 환자림프구 +환자혈청 공여자림프구 +공여자혈청
검사 과정 T-NIH B-WARM 순서 T-AHG 1.혈청 + 림프구 2. WASH 3.anti-kappa 실온 30분 실온 60분 37℃ incubator 60분 2. WASH - 3회(RPMI 원액 5㎕/well) 2500 rpm, 2min 3.anti-kappa 1㎕/well, AHG 를 1:40 dilution 1′30″안에 시행 4. Complement C′ for T 5㎕/well 실온 1시간 실온 2시간 C′ for B 실온 3시간 5. 5% eosin Y 5㎕/well, 3 - 5분 방치 6. Formalin 10㎕/well, 20 - 30분 방치 7. Cover glass 덮고 30-60 분 방치 8. 현미경 판독 : 죽은 세포의 백분율(%)을 기록
임상적 의의 ① 초급성 거부반응의 원인 ② 음성 반응을 확인한 후에 장기이식을 시행 ③ T 림프구에 대한 항체가 양성인 경우: 이식 금기 ④ B 림프구에 대한 항체가 양성인 경우: 이식 금기 사항은 아니지만 높은 역가일 때 이식 성적이 불량
PBS로 중첩 후 원심분리한 사진
염색 전후의 Microplate
1㎕, 5㎕, multi hemilton syringe