Title : Analysis of AZFa region related spermatogenic failure 제 22회 랩세미나   Title : Analysis of AZFa region related spermatogenic failure 소 속 : 생물학과석사 1년 이 름 : 신 경 미 발표 일자 : 2001. 12. 10

Localization of AZF regiones in Y Chromosome USP9Y (or DFFRY) DBY UTY TB4Y Genes located in Yq11 Y specific multi-copy genes : CDY, DAZ, PRY, RBM, TSPY, TTY1, TTY2 X-Y homologous genes : DBY, DFFRY(USP9Y), E1F1AY, SMCY, UTY

Functions of AZF regiones AZFa : azoospermia – Sertoli cell only phenotype (USP9Y, DBY) 2. AZFb : azoospermia – meiotic arrest (RBMY) 3. AZFc : azoospermia / severe oligospermia (DAZ) 4. AZFd : mild oligospermia ( ? )

 연구 목적 인간의 정자형성 과정에 AZFa,b,c영역이 관계되어져 있다고 알려져 있는데, AZFa phenotype이 어느 유전자들에 의해 야기되는지는 여전히 논쟁중이다. 그리하여 여기서는 AZFa 영역에 존재하는 유전자의 특성과 불임 환자들에서 유전자 각각의 deletion analysis를 실행하여 AZFa의 candidate gene이 무엇인지를 밝혀 내고자 함.   Introduction AZFa, AZFb, AZFc 영역의 deletion이 남성불임에 책임이 있음. AZFa region의 genes의 특징. USP9Y : ubiquitin-specific protease 9, Y chromosome의 약어로 DFFRY(Drosophila fat facets related Y) 로서 알려져 있음. Oligozoospermia phenotype와 연관이 있다고 제시되고 있음. RNA-binding protein 을 코드하는 AZFc region의 DAZ, AZFb region의 RBMY와는 달리 이것은 ubiquitin C-terminal hydrolase로서 기능을 하고 모든 조직에서 발현.   DBY : DEAD/H box polypeptide, Y chromosome의 약어로 more severe testiculopathy( Sertoli cell-only syndrome)과 연관이 있음. UTY : ubiquitously transcribed tetratricopeptide repeat gene, Y chromosome의 약어임. 

Results 1) Physical map of the AZFa region and genomic structure of USP9Y, DBY and UTY. GenBank에 있는 9개의 BAC clones을 이용하여 AZFa region의 physical map을 완성함. BAC clone에서 UTY의 중간부분에 해당 부위가 없음 USP9Y DBY UTY USP9Y gene deletion DBY/UTY gene deletion USP9Y/DBY gene deletion DBY와 USP9Y와의 거리는 45kb정도이고, UTY와의 거리는 330kb 정도로 떨어져 있음.

A B C USP9Y : 159kb의 DNA로 되어 있고 46개의 exon으로 구성되어 있음. (80bp의 exon4에서부터 751bp의 exon35까지 다양한 길이로 구성되어 있음.) DBY : 15.5kb의 DNA로 되어 있고 17개의 exon으로 구성되어 잇음. (45bp의 exon1에서부터 182bp의 exon13까지 다양한 길이로 구성되어 있고, 74bp의 intron13에서부터 2.5kb의 intron1까지 다양한 길이로 구성되어 있음.) alternative transcript1의 poly(A) tail은 stop codon으로부터 258bp downstream에 위치해 있는 반면, alternative transcript2는 2.1kb 3’UTR을 부가적으로 더 가지고 있음. intron1(2.5kb) intron13(74bp) A Exon1(45bp) Exon13(182bp) Alternative transcript 1 Alternative transcript 2 B C ATP binding ATP hydrolysis/RNA binding ATP hydrolysis/RNA unwinding

2) AZFa deletion alnalysis in infertile patients 불임 환자를 선정한 기준 2가지 # Sertoli cell-only syndrome의 특징을 가지는 idiopathic infertility환자로서 azoospermia/oligozoospermia여야 하든지, hypospermatogenesis이어야함. (Sertoli cell-only syndrome : complete absence of spermatogenic cells, hypospermatogenesis : quantitative reduction of these cells라는 뜻임.) # AZFa영역외 Yq영역은 정상이어야함. Control : 정상적인 가임 남성 100명과 다른 이유로 불임인 80명의 불임 환자를 선정함. 실험결과 : 환자의 genomic DNA에 22개의 STS marker을 사용해서 9명의 환자가 AZFa영역의 일부가 deletion되어 있음을 발견함.(9/173, 5.2%). control에서는 어떠한 deletion도 발견되지 않음. Sertoli cell-only syndrome환자에서는 deletion이 9.7%에 달하는 빈도를 나타냄. 9명의 환자중 USP9Y를 포함하는 deletion도 있었고 UTY를 포함하는 deletion도 있었으나 9명중 8명이 DBY를 포함하고 있고 그중 6명이 DBY를 확실히 deletion하고 있는 것을 볼 때 이 유전자를 major AZFa candidate로 지시할수 잇고 이 유전자가 분명 정자 형성에 중요한 역할을 할 것이다. 41 idiopathic azoospermia SCOS 4(9.7%) 173명

Discussion 3) Expression analysis of AZFa genes and their X-homologues DBY, UTY, USP9Y의 specific primer를 이용해서 cDNA library를 재료로하여 PCR을 실행하여 expression analysis를 함. DBY, UTY, USP9Y의 specific primer를 이용해서 그들의 X-homologues DBX/DDX3, UTX, USP9X를 찾음. DBY는 두개의 다른 전사체를 만드는데 alternative transcript2(long 3’UTR)는 모든 조직에서 발현하지만 alternative transcripts2(short 3’UTR)은 testis specific expression되고 있음. USP9Y, USP9X, UTY, UTX, DBX/DDX3는 모든 조직에서 발현되고 있다. ovary Testis Discussion DBY is the major AZFa candidate. 1. alternative transcript1은 testis specific expression(DBX/DDX3는 모든 곳에서 발현.) 2. alternative transcript1는 정자 형성 과정중 X-homologue와는 다른 기능을 할 것임.   DBY가 지시하는 protein(DDXY)은 DEAD box를 가지는데 이것은 putative ATP-dependent RNA helicase 기능을 하는데 Asp-Glu-Ala-Asp의 peptide 서열을 특이적으로 가지고 있음. DDXY는 mouse PL10와 다른 subclass인 mouse DEAD3/Ddx3와도 아미노산 유사도가 매우 높음. ( DBY는 PL10과 89%의 amino acid identity를 가지고 mouse DEAD3/Ddx3와는 91%의 유사도를 가지는데 중요한 것은 DEAD box가 더 높은 유사도를 가짐.) PL10은 male germ-cell-specific하고 정자형성과정중 spermatocytes의 시기에 높은 발현량을 들어냄으로써 발생학적으로 조절되어짐. PL10은 mouse testis cDNA library에서 동정되어졌고 이것은 AZFa영역에 해당하는 human Yq영역에서 12f3이라 불려지는 것으로 동정되어짐.

연구목적 Introduction 1999. Nature AZFa,b,c의 지역에서 candidate gene가 동정되었지만, 정자 형성의 실패 원인이 point mutation에 의해서나 single Y-linked gene의 deletion에 의해서 유래한 경우는 없었다. 여기서는 Y chromosome의 AZFa region을 sequencing하여서 두개의 functional genes(USP9Y, DBY)을동정하였는데 이 기능 유전자가 전자의 설명과 연관이 있는지를 조사하고자 함.  Introduction 576명의 불임환자와 96명의 가임 남성에서 두개의 유전자를 조사하였는데 몇몇의 sequence variants를 드러냈고, 그것들의 대부분이 유전적이고 거의 기능이 없는 결과였다. 여기서는 USP9Y에서 하나의 de novo mutation을 발견했다. Splice-donor site에서 4bp의 deletion을 드러냈는데 이것이 exon을 지나치게 만들어서 protein truncation을 야기한다. 이 mutation은 nonobstructive azoospermia(즉, 어떤 정자도 정액에서 보여지지 않는 상태)의 병을 가진 한 환자에서 존재하였다. 그러나 가임 가능한 그의 형제의 경우에서는 부재되어 있었다. 이러한 것은 USP9Y mutation이 spermatogenic failure을 야기함을 제시한다.

1) 정상 남성으로부터 얻은 genomic library를 BAC clones을 Results 1) 정상 남성으로부터 얻은 genomic library를 BAC clones을 이용해서 AZFa region map을 구축화했다.(USP9Y, DBY, UTY유전자를 map되었고 여기에는 적어도 11개의 pseudogenes가 존재함.)   2) Y-chromosome deletion에 대해 불임 남성을 연구하는 동안 azoospermic 환자(WHT2996)이 sY86과 sY87에 해당하는 Yq region이 deletion되어 있음을 알아냄. 이런 deletion은 WHT2996의 아버지에서는 발견되지 않았다는 점에서 볼 때, WHT2996에서 새롭게 mutation이 일어나서 WHT2996에 spermatogenic failure의 원인이 되었음을 제시함. 3) UTY는 WHT2996환자의 deletion에서부터 150kb정도밖에 떨어져 있지 않아서 position-effect silencing의 가능성이 제시되었지만 RT-PCR에 의해서 이러한 가능성은 제외됨. 결국 USP9Y, DBY의 소실이 AZFa-deleted men과 WHT2996환자의 정자형성에 영향을 준다고 할 수 있음. sY86 sY87 USP9Y, DBY의 point mutation을 조사하는 576명 불임 환자 의 두 가지 기준. 1. nonobstructive azoospermia이거나 severe oligospermia(<5 million sperm/ml semen)를 가진 환자. 2. AZFa region을 포함한 Y chromosome이 대체로 정확하여 야 함. 3. control로써 96명의 가임 남성을 조사함.

분석방법과 결과. USP9Y와 DBY의 exon과 splice sites을 SSCP(single-strand conformation polymorphism analysis)또는 DHPLC(denaturing high-performance liquid chromatography)을 사용하여 조사함. USP9Y에서 5개의 다른 variants를 발견함(DBY는 발견되지 않음.) 5개중 4개의 variants는 아버지로부터 전이되었던지, 가임 형제에서도 존재하였고 가임 control환자에서도 발견되어졌다. 이것은 exon24번에서 나타난 nonsense mutation이어서 대부분의 USP9Y전사체의 splicing동안에 지나쳐 버려서 reading frame을 파괴하지 않는다. 나머지 하나의 variant는 USP9Y protein을 truncation시키는 de novo mutation임. USP9Y intron7의 splicing-donor site에서의 4bp deletion이 발견됨.-이 deletion은 exon7의 skipping을 야기하여 reading frame을 변화시키고 USP9Y protein을 약 90%까지 truncation시킴. Intron7 GTAA (splice donor) deleted ## References Human Y chromosome azoospermia factors (AZF) mapped to different subregions in Yq11. Human Mol. Genetics, (1996) AZFa deletions in Sertoli cell-only syndrome: a retrospective study. Molecular Human Reproduction(2000) High deletion frequency of the complete AZFa sequence in men with Sertoli-cell-only syndrome. Molecular Human Reproduction(2001)