Basic Microbiology
용어 산소가 있는 조건 하에서 자라는 균으로 일반세균이라고 총칭 호기성 세균(일반세균) 산소가 있는 조건 하에서 자라는 균으로 일반세균이라고 총칭 장내세균 glucose를 발효하여 가스 and or 산을 생성하는 그람 음성균 Citrobacter, Enterobacter, Escherichia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, Shigella, Yersinia 대장균군 호기성 혹은 통성혐기성의 그람음성균, 포자를 형성하지 않는 간균으로 lactose를 발효하여 산 and 가스를 생성. 위생의 척도로 사용 Escherichia coli 은 대장균군의 전형적인 종류.
대장균 효모 포도상구균 대장균군의 종류로서 β-glucuronidase라는 효소를 생산. 출아에 의하여 증식하는 round type의 fungi 를 총칭하는 일반적인 용어 포도상구균 그람양성, 호기성균 식중독균
MICROORGANISM FAMILY TREE
10 Pathogens in Korea Bacillus spp. Listeria monocytogenes Campylobacter jejuni Salmonella spp. Clostridium botulinum Clostridium perfringens Staphylococcus aureus Vibrio parahaemolyticus Escherichia coli O157:H7 Yersinia enterocolitica
미생물검사의 목적과 의의 목적 : 안전하고 우수한 식품확보 1. 식품의 품질관리 - 식품의 신선도 보증 (변패와 부패의 진행정도 판정) - 식품의 미생물오염정도 확인 - 그 식품에 이용되고 있는 유용미생물 확인 2. 병원성 미생물 오염여부 확인 - 식품위생적인 측면에서 중요 - 식중독 및 부패미생물의 오염여부 판별
우유 및 유제품에 의한 식중독 발생 (2000년) 현황 : 식생활 형태의 변화 및 집단급식소 증가로 식중독 발생건당 환자수 증가(건당 69.6명) 원인균 : 살모넬라(28.8%)>장염비브리오(13.5%)>포도상구균(9.6%) 원인식품 : 육류 및 가공품(27.9%)>어패류 및 가공품(25.9%)> 김밥,도시락등 복합조리식품(24%) 우유 및 유제품에 의한 식중독 : 29건 환자 3,571명 대표적인 우유식중독사건 : 일본, 명문유키지루시유업(雪印乳業) 식중독사건 - 발생 : 2000년 여름 - 원인 : 우유생산라인의 가설밸브 S. aureus 감염 - 환자 : 1만명 이상
1. Pathogenic organisms 2. Indicator organisms E.coli : 분변 오염에 의한 병원성의 지표세균 Coliform : E.coli 확정실험이 너무 오래 걸려서 E.coli 대신 널리 사용 장내 세균 : lactose-negative pathogenic bacteria의 지표균 Fecal Coliform : 44 ~ 45oC의 고온에서 배양 후 나오는 coliform 결과로써 이 온도에서 비E.coli성 coliform은 대부분 생장이 어렵다. 황색포도상구균 : post-processing contamination의 지표균
오염지표 미생물 검사 식품의 신선도를 감별하는 좋은 지표는 일반세균수 측정이며, 대장균군의 검사는 식품위생의 척도로서 식품이 분변에 의하여 오염되었는지의 여부를 가늠하는 지표 1. 호기성 중온성 세균 (aerobic mesophilic bacteria) - 발효식품을 제외하고 식품 중에 다수의 균이 존재한다면 위생 적으로 불안전한 것으로 간주 - 원료의 오염, 불만족스런 위생관리, 생산/저장기간 동안의 부적절한 온도, 시간조건에 노출 - 균종이 중온성세균 (35-37℃)일 경우 다수의 병원성균이 존재가능
2. 균수 - 총균수 : 일반적인 위생상태의 척도 - 대장균수 (E 2. 균수 - 총균수 : 일반적인 위생상태의 척도 - 대장균수 (E. coli) : 분변오염지표균 - 대장균군수 (Coliforms) : 근본적인 분변오염을 의미하는 것 은 아니며, 위생지표로서 공정중 오염 및 증식기회가 있었음 을 의미 3. 균종 - 장구균 (Enterococcus group) : 식품제조 공장의 분변오염 지표이나 대장균과의 상관관계가 높지 않아 분변오염지표로 서 많이 사용되지 아니함
- 연쇄상구균 (Streptococcus salivarius) : 구강오염지표 - 포도상구균 (staphylococci) : 피부, 코, 입의 오염지표 - 클로스트리디움균 (clostridia) : 통조림 제품의 부적절한 열처리 지표 4. 일본의 식품의 미생물지표 - 대장균군 : 가열살균지표 - 대장균 : 제조시 분변오염지표 - 클로스트리디움속균 : 가열후의 적정냉각지표 - 황색포도상구균 : 제조시 손 및 기구에서의 오염지표 - 살모넬라속균 : 식육제품과 관련한 식중독균의 오염지표
일반세균수 검사 시료중에 존재하는 세균중 표준한천평판배지에서 발육할 수 있는 중온성균의 수 직접 현미경법 표준평판 배양법 1. 직접현미경법 2. 간접법 - 표준평판배양법 (혼합희석 배양법) - 표면도말배양법 - Petrifilm method (3M) - 멤브레인 필터법 - 나선평판배양법 (SPLC) 표준평판 배양법
표준평판배양법 표준한천평판배지에 시료를 혼합응고시켜 배양후 형성된 세균 집락수를 계수하여 시료중의 생균수를 산출하는 방법 1. 기구 및 재료 - 멸균기 - pH meter - 배양기 - 균질기 (stomacher, bag) - 항온수조 - 피펫 - 냉동 및 냉장고 - 시험관 및 희석병 - 집락계산기 - 페트리디쉬
표준평판배양법 2. 시험방법 배양 : 채취한 시료액 1ml, 희석액 9ml를 혼합하여 십진희석하여 각 단계별 희석액 1ml씩을 페트리디쉬에 취한 다음, 표준한천평판배지와 섞어 응고시킨 다음, 35℃/48~72hr 배양한다. 집락수 산정 : 배양후 30-300집락 형성된 평판을 택하여 계수 - 300개 이상의 평판 : 250에 가까운 평판에 대하여 계수 - 30개 이하의 평판 : 희석배수가 가장 낮은 것을 계수
3M Film법 원리 : 미생물 생장에 필요한 영양소, 수용성겔 및 균체 지시약들을 종이에 특수코팅한 필름배지로 상품화된 검사 키트로서 희석시액 1ml를 접종하고 배양후 균수를 측정하는 방법 검사방법 - 시료를 10진법으로 단계희석한다. - 희석액 1ml를 film 중앙에 수직으로 접종한다. - 누름판으로 눌러 겔화가 되도록 1분 정도 정치한다. - 35℃/24-48hr 배양한다. - 계수한다.
자동화검사장비를 이용한 세균수 검사법 박토스캔 (Bactoscan) : 원유중의 미생물을 형광염색 물질로 염색하여 형광현미경을 통해 연속적으로 세균을 계수 Impedance method : 전도물질에 흐르는 교류전류에 대한 저항의 원리를 이용하여 배지에 접종된 미생물의 대사산물들로 인한 전기적인 impedance 변화량을 측정 - Bactometer/ Malthus(Conductance) ATP method : 생균에 존재하는 ATP를 추출하여 생물발광성(bioluminescence)에 ATP가 소모되는 원리를 이용하여 미생물수를 측정하는 방법
대장균군 시험 Coliform group이란 그람음성, 무포자간균, 유당을 분해하여 가스를 생성하는 호기성, 또는 통성혐기성균 - 정성시험법 : 유당 bouillon법, BGLB법 - 정량시험법 : Desoxycholate agar, Violet red bile agar, 최확수법 1) 추정시험 - 액체배지 : 적당히 희석한 시료를 2% BGLB 배지에 0.1-1m씩 접 종하여 35℃, 48hr 배양하여 가스가 발생하면 추정시험 양성으로 판정 - 고체배지 : Desoxycholate agar, Violet red bile agar에 시료를 혼 합하여 35℃, 24hr 배양하여 직경 0.5mm이상의 암적색 집락이 발 생할 경우 추정시험 양성으로 판정
대장균군 검사 2) 확정시험 -BGLB 배지에서 가스생성균을 EMB, Endo agar에 균을 도말배 양하여 전형적인 대장균군 집락을 확정시험 양성으로 판정하고 다음 단계의 완전시험으로 들어감 -비전형적인 집락일 경우 완전시험으로 들어감 3) 완전시험 - 그람음성, 무포자간균, 유당분해 가스생성균을 확인하는 시험 - 확정시험에서 비전형적인 집락은 2개 이상을 취하여 유당 bouillon 발효관과 보통 한천사면배지에 이식하여 35℃, 48hr 배양하여 가스생성하면 그람음성, 무포자간균임이 확인되면 완 전시험 양성으로 판정
대장균 검사 Indole 반응 : 균을 SIM 배지에 찔러 접종하고, 37℃, 18시간 배양한 다음 motility, H2S production - Enrich-bohme법 : 작은 시험관에 enrlich 시약 1ml를 관벽으로 흘러 내려 충적시켜, 경계면에 적자색이 나타나면 양성 - Kovac법 : 클로로포름 0.5-1ml를 배지위에 중층시킨 다음 Kovac시약 0.5ml를 가하여 적색으로 변하면 양성 Methyl red 반응 : 포도당 인산염 펩톤수(MR-VP broth)에 균을 심어 37℃, 2일간 배양한 다음 methyl red 시약 5-6방울을 떨어뜨려 적색으로 변하면 양성으로 판정
대장균 검사 Voges-Proskauer 반응 : 포도당 인산염 펩톤수에 균을 심고 30℃, 24시간 배양하여 6% α-naphthol alcohol 용액 0.5ml와 40% 수산화칼륨용액 2ml를 가하여 흔들어서 적색으로 나타나면 양성 구연산염 이용 시험 : Simmons 구연산염나트륨 사면한천배지에 균을 도말하여 35-37℃, 48시간 배양하여 배지가 짙은 청색으로 나타나면 양성으로 판정