Lecture 13 Hemostasis and Coagulation Keohane EM et al, 2016, Chapter 37 Elaine M. Keohane, PhD, MLS(ASCP),SH keohanem@shrp.rutgers.edu Rutgers-The State University of New Jersey School of Health Related Professions and Kyung Jin Cho, PhD chokj@korea.ac.kr Korea University, College of Health Sciences Jun 7, 2019

- Primary Hemostasis Hemostasis(지혈) √ 출혈을 초기에 막기 위해 혈소판 지혈마개(일차 혈병)를 형성 - Secondary Hemostasis √ 혈소판 또는 TF-함유세포 (SMC/FB)표면에서 응고인자 들이 반응하여 최종적으로 섬유소를 형성하여 보다 안정화된 지혈마개(혈병)를 유지 - Fibrinolysis 더 이상 필요 없게 된 지혈마개(혈병) 용해로 지혈 종결 (출혈과 혈전 사이에서 균형 유지 기능)

모세혈관,동맥과 정맥의 구조 √ Dreamstime.com Capillary Dreamstime.com https://www2.highlands.edu/academics/divisions/scipe/biology/faculty/harnden/2122/notes/cvbv.htm √ Internal elastic lamina

혈소판 점착/응집으로 지혈마개 형성 응고인자활성화로 섬유소형성 Table 37-2. 내피세포의 항응고 및 응고촉진 기능 Rodak 혈액학, 5th 2019 p665 혈소판 점착/응집으로 지혈마개 형성 응고인자활성화로 섬유소형성

지혈과 혈관내막 (일차적지혈): Vascular Intima in Hemostasis

온전한 내피세포의 응고저지(혈류유지) 기능 손상된 내피세포의 응고촉진기능 Endothelin Fig 37-2. 내피세포의 항응고 및 응고촉진 기능 Rodak 혈액학, 5th 2019 p666

Table 37-2. 내피세포의 항응고 및 응고촉진 기능 Rodak 혈액학, 5th 2019 p667 Ca++ ↑

손상된 혈관벽에 혈소판과 vWF 의 점착 노출된 SMC/FB: TF발현 Fig 37-3. Keohnae EM, et al., Rodak 혈액학 5th 2019 p668

혈소판 점착: PLT, VWF, Collagen의 역할 √ Bernard-Soulier syndrome(BSS)는 혈소판수용체 GP Ib/IX/V의 결함에 의한 혈소판 점착 이상 √비정상적 백색혈전(PLTs, vWFs)은 AMI, stroke의 유발 가능 Fig 37-4. Keohnae EM, et al., Rodak 혈액학 5th 2019, p668

혈소판 응집: Plt, Fibrinogen, RBC의 역할 GP IIb/IIIa recognizes and binds RGD(Arg-Gly-Asp) sequence complex in fibrinogen and vWF Fig 37-5. Platelet Adhesion. Keohnae EM, et al., Rodak 혈액학 5th 2019, p669 √ Glanzmann’s thrombasthenia (GT)는 섬유소원과 vWF의 RGD 서열에 결합할 혈소판수용체 GP IIb/IIIa의 결함으로 응집 이상. √ 비정상 적색혈전은 심부정맥혈전증을 유발할 수 있음

√ Keohane EM et al., Rodak 혈액학, Elsevier, 5th Ed, 2019, p668

√ √ √ √ √ √ √ Keohane EM et al., Rodak 혈액학, Elsevier, 5th Ed, 2019, p669

Arachidonic acid와 Aspirin 효과 그림 13-20 Eicosanoid합성 참조 √ PL ADP P2Y P2Y: ADP수용체 PLA2 convert membrane PL into arachidonic acid. Fig 37-6. Keohnae EM, et al., Rodak 혈액학 5th 2019, p670

Secondary Hemostasis (이차적지혈): Coagulation

응고인자(효소원), 보조인자, 조절단백, 기질 Zymogen 활성형: Serine protease Fig 37-7 Keohane EM et al., Rodak Hematology, Elsevier, 5th Ed, 2016, p649

응고기전의 단순모형(Cascade Reaction): Plasma-Based Model Extrinsic Intrinsic Common VII TF XII XI IX VIII PK HMWK X V II I Clot

혈장내 응고인자 Serine Protease: IIa, VIIa, IXa, Xa, XIa, XIIa, Kallikrein, (APC, AT-inhibitors) Vit K-dependant facors: II, VII, IX, X, PC, PS, PZ Cofactors: TF(III), V, VIII, HMWK, Protein S, Protein Z, TM Control proteins: PC, AT, ZPI, TFPI, Heparin Cof II, α1-anti-trypsin, α2-macrogl. Substrate: Fibrinogen Transglutaminase: XIIIa √ Serine protease: proteolytic enzymes of trypsin family that include activated procoagulants(IIa, VIIa. IXa, Xa, XIa, XIIa, Kallikrein, and activated APC, AT. Serine proteases cleave peptide bonds in proteins, in which serine serves nucleophilic AA at the active sites. (Active sites: where substrate binds and undergoes chemical reaction) Control proteins: maintain the balance between thrombosis and abnormal bleeding Keohane EM et al., Rodak Hematology, Elsevier, 5th Ed, 2016, p649

혈장내 응고인자 - 계속 Cont’d Keohane EM et al., Rodak Hematology, Elsevier, 5th Ed, 2016, p649

응고인자 요약 √ 응고인자 합성장소: 모든 응고인자는 간에서 합성 저장 시 불안정 인자: V, VIII V인자와 XIII인자는 거핵구에서도 합성되는 것으로 알려 짐 VIII인자도 간 이외의 장소(내피세포?)에서 합성되는 것으로 추측 [응고인자 별 특성] 저장 시 불안정 인자: V, VIII EDTA에서 불안정 인자: V (응고검사실: Sod citrate 사용 ) √ 냉장온도에서 활성화/소모되는 인자: VII(검체냉장:PT연장) √ 반감기 가장 짧은 인자: VII (6 시간) √ 염증시 증가하는 인자(APR): Fibrinogen, VIII √ 가장 높은 농도의 인자: Fibrinogen (200-400 mg/dL) √ 혈청내 없는 인자: I, II, V, VIII, XIII 유전적으로 X-염색체관련 인자: VIII, IX

√ Feed-back !! Table Fig 37-6 Keohane EM et al., Rodak Hematology, Elsevier, 5th Ed, 2016, p650

특성에 따른 응고인자 그룹 √ √ √ 섬유소원Group – I, V, VIII, XIII 혈병형성과정에서 소비 (혈청 내 없음) Thrombin에 의해 다시 활성화 (feed-back: thrombin burst !!) 프로트롬빈 Group – II, VII, IX, X, Protein C, S, Z 기능적 인자로 전환하기 위해 Vitamin K 도움 필요 간에서 인자 분비 전 Vit K에 의한 번역 후 변형(translational modification)이 필요. 즉 각 인자 N-말단 소재 10-12개 글루탐산 잔기의  -탄소에 COO- 하나를 추가하는 -카르복실화 (Gla)가 이뤄져야 2가양이온 Ca++과 협력하여 혈구막 인지질(PL)과 함께 세포표면에서 응고복합체형성에 기여하게 됨 접촉인자Group – XII, XI, PK, HMWK (접촉인자 feedback) XII, PK, HMWK인자는 in-vitro 내인계경로 활성화에서 중요; 정작 XII, PK, HMWK 결핍 되더라도, in-vivo 출혈증상 안 나타남 항혈우병인자 XI 인자 결핍 시 출혈증상이 없을 수도 있음 √ From Precursor form (GLU domain) to GLA form √

Vit K에 의한 번역후-변형 γ-카르복실화 √ Vit K VII, IX, X, PC,PS, PZ Gla(γ-carboxy glutamic acid)도메인은 Ca2+과 높은 친화성 결합에 결정적 Fig 37-9 Keohane EM et al., Rodak 혈액학, Elsevier, 5th Ed, 2019, p673

√ Table Fig 37-7 Keohane EM et al., Rodak Hematology, Elsevier, 5th Ed, 2016, p650

섬유소원 구조 D E Fig 37-12. Keohnae EM, et al., Rodak Hematology 5th p654

섬유소원 도메인과 Thrombin의 절단 √ Fig 37-12. Keohnae EM, et al., Rodak Hematology 5th p654

안정화된 섬유소(혈전)의 형성 √ Fig 37-13. Rodak 혈액학 5th 2019, p677 응고검사의 종말점 공유결합 5M Urea에서의 불용성 공유결합 응고검사의 종말점 √ Fig 37-13. Rodak 혈액학 5th 2019, p677

In Vitro Blood Coagulation: Plasma-Based Model Extrinsic Intrinsic Common VII TF XII XI IX VIII PK HMWK X V II I Clot

In-vitro 혈장-기반 응고기전 √ PTT PT Extrinsic Intrinsic 표면접촉 Tissue Thromboplastin, PL, Ca++ PF3 (Partial thromboplastin) Neg charged surface (activator) PT PTT Fig 37-14. Rodak 혈액학,5th 2019, p678

Extrinsic Tenase complex in-vitro 혈장-기반 응고기전 - 계속 Extrinsic Ca2+ TF-VIIa VII VIIa Tissue Factor (TF) Extrinsic Tenase complex X Xa 외인계기전-관련 인자 : VII

Intrinsic Intrinsic tenase complex 내인계-관련 인자: XII, XI, IX, VIII In Vitro Blood Coagulation- Plasma Based Model – Cont’d Intrinsic X Xa XI Ca2+ Prekallikrein HMWK XII XIIa Neg charged Surface (Kaolin) XIa IX IXa Phospholipid VIIIa- Intrinsic tenase complex 내인계-관련 인자: XII, XI, IX, VIII

Common 공통계-관련 인자: X, V, II, I Prothrombinase complex Thrombin (IIa) In Vitro Blood Coagulation- Plasma Based Model – Cont’d Common X Xa Prothrombin (II) Fibrinogen (I) Fibrin Monomer Fibrin Polymer (Gel) Cross-Linked Fibrin XIII XIIIa Thrombin (IIa) Va-Xa Ca2+ Prothrombinase complex 공통계-관련 인자: X, V, II, I

Intrinsic Common Thrombin (IIa) Extrinsic In Vitro Blood Coagulation- Plasma Based Model – Cont’d Intrinsic XI Ca2+ Prekallikrein HMWK XII XIIa Neg Charged Surface XIa IX IXa Extrinsic IXa VIIIa- Ca2+ Phospholipid TF-VIIa VII VIIa Tissue Factor (TF) X Xa Common Prothrombin (II) Fibrinogen (I) Fibrin Monomer Fibrin Polymer (Gel) Cross-Linked Fibrin XIII XIIIa Thrombin (IIa) Va-Xa

지혈에 있어서의 Thrombin 역할 Thrombin (IIa) IIa VIII VIIIa V Va XIII XIIIa XI Cross-Linked Fibrin Fibrinogen (I) Fibrin XI XIa Thrombin (IIa)

응고경로 단순화 모형 √ Thrombin의 Feed-back (V, VIII, XI 활성화) Contact group Fig 37-8 Keohane EM et al., Rodak Hematology, Elsevier, 5th Ed, 2016, p650

막 응고복합체 (Membrane Coagulation Complexes) Thrombin형성 과정에서 Vit K-의존형인자들은 세가지 막 응고복합체 (Extrinsic tenase, Intrinsic tenase, Prothrombinase) 조립위해 필요한 성분 Vit K-의존형SPs, 보조인자, Ca2+이온으로 구성되는 막 응고복합체 들은 활성화된 혈소판이나TF-발현 세포의 음전하 대전한 막 인지질에 결합하여 인자활성화 유도 Ca2+ √ Fig 37-10. Rodak 혈액학 5th 2019, p674

Table 37-8 Rodak 혈액학, Elsevier, 5th Ed, 2019, p674

세포-기반 in-vivo (생리학적) 응고 Burst √ 혈관외 TF-발현세포에서의 개시 단계: 소량(3-5%) thrombin생성 이루어짐 Thrombin 생성의 95% COAT(collagen and thrombin activated): 노출된 Coll에 혈소판점착과 Thrombin에 의해 활성화 Factor X 활성화 50배 혈관내 혈소판상에서의 전파 단계: Thrombin생성의 95% cover TF-발현세포의 개시: 소량의 X, IX 활성화 Intrinsic tenase Prothrom- binase Extrinsic tenase feed-back Coagulation complexes bound to cell membranes are relatively protected from inactivation by inhibitors. However, if Xa:Va dissociates from the cell, it is rapidly inactivated by protease inhibitors TFPI, AT, and ZPI The IXa:VIIIa intrinsic tenase activates factor X 50 to100-fold higher rate than extrinsic tenase. Factor Xa binds to Va to form Prothrombinase complex, which activates prothrombin and generates a burst of thrombin COAT platelets provide a surface for formation and amplification of IXa:VIIIa complex and Xa:Va complex Fig 37-15. Rodak 혈액학 5th 2019, p679

Table 37-9 Keohane EM et al., Rodak 혈액학, Elsevier, 5th Ed, 2019, p674 √

vWF-VIII 복합체 √ Fig 37-11. Rodak 혈액학 5th 2019, p675

응고조절단백 (응고억제인자) 조절단백의 기능: 출혈과 혈전 사이에서 균형 유지 조절단백의 기능: 출혈과 혈전 사이에서 균형유지

Table 37-10 Keohane EM et al., Rodak 혈액학, Elsevier, 5th Ed, 2019, p680 응고조절 단백 (응고억제인자) TF:VIIa +Xa복합체에 TFPI결합

Activated Protein C (APC); Protein S (APC 보조인자) 주요 응고억제인자 (SERPIN) √ Antithrombin (AT) 트롬빈(IIa), IXa, Xa, XIa, XIIa, Kallikrein 등의 serine protease를 결합하여 중화시키는 SERPIN임 Activated Protein C (APC); Protein S (APC 보조인자) 억제대상: Va, VIIIa √

SERPIN의 응고조절 부위 √ √ √ Fig 37-16. Rodak 혈액학 5th 2019, p680

조직인자경로억제인자 (TFPI) Fig 37-17. Rodak 혈액학 5th 2019, p681

Protein C (APC) 경로: 과다응고 억제 C4bBP: acute phase reactant √ √ 염증 시 C4bBP증가: bound form 증가로 상대적 free form 감소 이는 혈전 위험도 증가 C4bBP(C4b binding protein): Acute phase reactant(APR) Fig 37-18. Rodak 혈액학 5th 2019, p681

Major Anticoagulants √ Warfarin, Coumadin (경구용 항응고제) Vitamin K antagonist (slide#22 참조) 쿠마딘 투여는 간에서 합성 후 번역후 변형 실패로 γ-carboxylaton 이 이뤄지지 않아 기능 없는 II, VII, IX, X (PIVKA) 로 남아 PT, aPTT 연장 Warfarin 치료 투여량은 monitoring 되어야: Prothrombin Time (PT) and INR (>3.0) √ Unfractionated Heparin (정맥 내 투여) Anti-Thrombin(AT) 과 Thrombin을 결합 하여 IIa (thrombin)과 Xa 를 중화 IXa, Xia, XIIa도 기능 억제 헤파린 투여량도 monitoring 되어야: Activated Partial Thromboplastin Time (APTT)

√ 미분획 헤파린(UFH)의 AT-Thrombin반응 활성화 - AT는 UFH의 오탄당 특정서열에 결합 함. UFH에 의해 AT의 thrombin억제활성이 2000배 이상강화 Fig 37-20. Keohane EM et al., Rodak Hematology, Elsevier, 5th Ed, 2016, p659

섬유소용해작용: 섬유소 분해 Plasminogen Plasmin In clot √ FDP(섬유소용해산물) Plasmin In clot Fibrin √ 섬유소용해작용 활성인자: Tissue Plasminogen Activator (tPA) Streptokinase, Urokinase (uPA) *혈병형성 수 몇 시간 내 일어남 유리 plasmin은 섬유소원(I), V, VIII인자 등을 용해시킬 위험 √

섬유소용해작용 - 요약 √ Fig 37-23. Keohane EM et al., Rodak Hematology, Elsevier, 5th Ed, 2016, p662

섬유소 용해경로와 억제인자 염증이나 응고가 발생하면, 그 반응으로 내피세피와 상피세포/대식세포에서 각각 tPA나 uPA가 방출 됨 섬유소용해작용억제인자: TAFI, PAI-1, α2-antiplasmin FDPs Digest I, VII, VIII and fibronectin: fatal fibrinolysis Free plasmin digests I, VII, VIII and fibronectin, causing a potentially fatal primary fibrinolysis Fig 37-21. Keohane EM et al., Rodak Hematology, Elsevier, 5th Ed, 2016, p660