Preparation and concentration determination of plasmid DNA from E.coli : Midi-scale preparation 2013-2학기 생화학실험(2) 담당교수 : 송재환 교수님 담당조교 : 이동주

Plasmid

Components of plasmid DNA Plasmid DNA component Origin of replication 2. Selectable marker (Antibiotic Resistance gene) 3. Multiple cloning site P53 (pcDNA3) -> 394개 아미노산 = 1182bp -> Total bp: 5402 + 1182bp = 6584 bp

Plasmid DNA for gene cloning Principle of gene cloning 1. plasmid DNA replication 2. cell proliferation colony 8~12h, 37℃, 210rpm Incubation

Plasmid DNA for gene cloning <Cell harvest> Types of preperation DNA yield(ug) Mini 100ug> Midi 100-350 Maxi 500-850 Mega 1500-2500 Giga 7500-10000 purification scale

Plasmid purification method CsCl-Ethidium Bromide gradient equilibrium centrifugation Cs ion과 Cl ion을 원심분리관 바닥쪽으로 잡아당겨 밀도구배가 형성된다. 물질의 부유밀도에 따라 밴드가 형성된다. CsCl용액에 EtBr를 가해 원심분리 시키면 supercoiled DNA와 non supercoil DNA를 분리할 수 있다. 이중나선이 풀리면 농도가 낮아지나 말단 부위가 없는 supercoiled DNA는 거의 풀리지 않으므로 부유밀도 감소는 소량이다. 이처럼 분리를 하여 추출한다.

Plasmid purification method Alkaline Lysis E.coli의 ccc형은 negative supercoil으로 되어있다. Plasmid를 분리할 경우에 cell로부터 얻은 DNA추출물을 pH 12 정도의 Alkali로 처리하면 염기간의 수소결합이 끊어져서 DNA가 변성되어 한 가닥으로 된다. DNA가 변성하면 한 가닥의 circular DNA와 한 가닥의 linear DNA가 생긴다.

Plasmid purification method Alkaline Lysis 직선상의 두 가닥으로 된 DNA가 변성하면 직선상의 한가닥 DNA만 생긴다. pH를 중성으로 되돌리면 쉽게 본래의 염기결합을 형성하여 원래의 ccc형 DNA가 재생된다. ccc형 DNA가 변성되더라도 중성의 조건으로 되돌아가면 쉽게 재생되는 성질을 이용하여 다른 형의 DNA로부터 구별하여 분리할 수 있다.

Plasmid purification method Anion-Exchange Chromatography Method 각 Buffer의 역할 Buffer EQU (low salt): DNA binding Buffer WASH (medium salt): RNA, protein, carbohydrate등의 제거가능 Buffer ELU (high salt): Salt가 DNA binding을 억제하여 elution이 가능 이때 용질과 고정상의 흡착을 일으키는 분자 사이의 인력은 수소결합 등이 있다.

Materials Alkaline cell lysis Anion-exchange-based DNA purification Solution I – Resuspension solution 50mM glucose 25mM Tris-Cl pH 8.0 10mM EDTA, pH8.0 Solution II – Lysis solution 0.2N NaOH 1%(W/V) SDS Solution III – Neuralization solution 5M Potassium acetate Glacial acetic acid Anion-exchange-based DNA purification Anion-exchange-based column Buffer EQU buffer-low salt Buffer WASH buffer-medium salt Buffer ELU buffer-high salt isopropanol 70% Et-OH D.W

Alkaline cell lysis Solution II – Lysis solution Solution I – Resuspension solution 50mM glucose = 삼투압을 유지시켜 세포의 외형을 유지시켜 준다. 25mM Tris-Cl pH 8.0 = ph를 맞춰줌 10mM EDTA, pH8.0 = 세포벽의 integrity를 유지하는데 필수적인 calcium ion을 제거하여 세포 벽이 군데군데 무너지게 만듬 Solution II – Lysis solution 0.2N NaOH = DNA가 세포가 깨지면서 밖으로 나왔을 때 DNA을 변성시키는 역할을 한다(염기성). 1%(W/V) SDS = 계면 활성제로 cell을 lysis 시킴 Solution III – Neuralization solution 5M Potassium acetate, Glacial acetic acid = 강력한 산으로 위에서 NaOH에 의해 염기성이 된 용액 을 다시 중성으로 돌려 놓음으로써 DNA 를 재결합시키는 역할을 한다.

Alkaline cell lysis method Procedures 1) Resuspension the pellet in 8 ml of Alkaline lysis solution I (Buffer RES) “ Vol. [ mL ] = Culture Volume [ mL ] x OD600 / 50” - Culture volume: 100ml , O.D600: 1.5 => 3ml 2) Add 8ml solution II (Buffer LYS) - Mix the contents thoroghly by inverting the tube several times(5 times). - Incubate the mixture at room temperature (18–25 °C) for 5 min. 3) Column equilibration (Buffer EQU) 12ml 4) Add 8 ml solution III (Buffer NEU) - inverting the tube several times(10 ~15 times) 5) Inverting the tube 3 times directly before applying the lysate to the equilibrate NucleoBond® Xtra Column Filter 6) Wash column filter and column (Buffer EQU) 8ml 7) Discard column filter

Anion-exchange chromatography method 7) Add 8ml of Buffer WASH into column and allow the column to empty by gravity flow 8) Elution - Add 5ml (Buffer ELU) 9) Add 3ml isopropanol 10) Centrifugate for 30min at 4500rpm at 4˚C in a centrifuge 11) Carefully decant the supernatant. Transfer to microcentrifugal tube. 12) Add 1ml of 70% Et-OH. 13) Centrifugate for 5min at 13000rpm, RT in a microcentrifuge 14) Carefully decant the 70% Et-OH. 15) Air dry 5min and redissolve the DNA in 50~100ul D.W.

Identification of purified plasmid DNA <Nano drop> ng/ul 의 단위로 확인 가능 Nano drop을 통해 plasmid DNA의 농도를 쉽게 구할 수 있다.

Identification of purified plasmid DNA Agarose gel loading 으로 purify 한 plasmid DNA의 state를 확인 할 수 있다. ex)- plasmid DNA의 size, impurity 여부 등

Result & Report 반드시 자필로 작성 할 것 제목/목적/원리/실험내용/결과,분석/고찰,문제풀이/참고문헌 고찰에 포함 할 내용 : 문제풀이 (마지막 슬라이드에 있음) Isopropanol을 넣어주는 이유 A260/A280 및 A260/230 ratio의 의미 및 결과분석 Nano drop의 원리 작성 및 결과분석에 적용할 것. E-mail: dongju@spin.yonsei.ac.kr (s403호)

Quiz E.coli를 배양하여, Alkaline lysis의 방법으로 DNA를 분리하는 과정에서, Solution I에 포함되어 있는 EDTA는 어떠한 역할을 하는가? 플라스미드 DNA를 cell로부터 정제를 하려고 한다. 5200ng/ul의 DNA 농도를 얻기 위해, OD260의 값이 얼마나 나와야 하는가? (희석배수 100) (문제도 함께 쓰고 풀이 해주세요.)