품종보호제도 강화를 위한 유전자 분석 기술의 활용 [2014 상생한마당] 품종보호제도 강화를 위한 유전자 분석 기술의 활용 2014년 6월 18일 국립종자원 재배시험과 홍지화

목 차 품종의 식별 방법 UPOV등 국외의 품종식별 분자표지 활용 논의 동향 종자원의 품종식별 분자표지 개발 현황 품종보호제도 강화를 위한 유전자 분석 기술의 활용 사례 향후 계획

Ⅰ. 품종의 식별 방법 (1.형태적 특성검정) 품종 : 하나의 유전자형 또는 유전자형의 조합에 의한 특성발현 (UPOV 91협약 1조 6항) ◎ 신품종의 품종보호 등록 요건 : DUS 요건 충족 구별성(Distinctness) : 조사특성 중에서 한가지 이상의 특성이 대조품종과 구별되는 경우 균일성(Uniformity) : 품종의 특성이 균일하게 발현 안정성(Stability): 연차간 균일성을 유지 ◎ DUS 검정 : 2년(2작기) 재배시험 수행, 재배환경의 영향을 받음 (출원 : 대조)

Ⅰ. 품종의 식별 방법 (2.유전자 분석) ◎ DNA 마커(분자표지) : 게놈(genome)상에서 다형성 여부를 판단할 수 있는 특정 염기 서열 단편 (염기서열 차이를 조사하는 지표) ◎ 유전현상의 본질인 DNA 염기서열 차이를 이용하여 품종을 식별 ◎ 환경 영향을 받지 않음, 단기간 분석, 객관적 판단이 가능 ◎ 품종식별 마커는 작물의 형태적 형질을 지배하는 유전자와 연관성이 불분명 ☞ 상대적인 유전적 조성 차이를 유추할 수 있으나, 품종동일성 판정에 직접적인 근거를 제공하지 못함 <아크릴아마이드젤 분석> <자동염기서열 분석>

Ⅰ. 품종의 판별 방법(형태적 특성/유전자) ◎ 유전자형과 표현형의 차이점과 연관성 DNA RNA 단백질 표현형 (cDNA 염기서열 기반) ☞ Genomic – SSR, AFLP, RFLP, CAPS, SCAR DNA RNA 단백질 표현형 ☞ EST- SSR, cDNA AFLP 유전자 비유전자 ☞ Protein marker ☞ DUS testing (Morphological marker)

II. 국제식물신품종보호동맹(UPOV)의 분자표지 활용 논의 동향 의장 행정법사위원회 식량 과수 화훼 채소 정보처리 기술위원회 자문위원회 실무기술위원회 생화학·분자생물학 사무국 ◎ 생화학·분자생물학 실무기술위원회(BMT)에서 분자표지 개발·활용에 관한 논의 · UPOV 가입국의 분자표지 개발 동향 발표, 소그룹 결성(옥수수, 유채, 감자 등) · 2014년 11월 10일~13일 서울(프레지던트 호텔) 개최 예정

II. UPOV의 분자표지 활용 논의 동향 1. BMT 가이드라인 제정(2010) ◎ 목적 분자표지의 선발과 DNA 데이터베이스 구축에 관한 유전자 분석 지침서 ◎ 내용 유전자 분석 방법의 선정, 분자표지 선정의 기준, DNA 데이터베이스 구축 방법 제시

II. UPOV의 분자표지 활용 논의 동향 1. BMT 가이드라인 ◎ 유전자 분석방법의 선정 재현성 다형성 DB 구축의 용이성 ◎ 유전자 분석방법의 선정 재현성 다형성 DB 구축의 용이성 염기서열 특이성 RFLP 있음 낮음 RAPD 없음 중간 AFLP 높음 SSR SNP SCAR CAPS 염기서열 기반 마커이나 품종식별 DB 구축에 활용보고가 적음 DNA 프로파일 database 구축에 적합한 마커

II. UPOV의 분자표지 활용 논의 동향 1. BMT 가이드라인 ◎ SSR(Simple Sequence Repeat) ◎ SNP(Single Nucleotide Polymorphism) 반복염기서열 분석법으로 DNA의 특정부위에서 단순반복되는 염기서열의 수가 차이 나는 부위를 증폭하여 품종을 식별하는 방법 단일염기 다형성 분석법으로 DNA의 특정부위에서 하나의 염기가 차이 나는 부위를 증폭하여 품종을 식별하는 방법 (AC)6 (AC)4 A 품종 B 품종

II. UPOV의 분자표지 활용 논의 동향 1. BMT 가이드라인 ◎ 분자표지 선정의 일반적인 기준 Useful level of polymorphism, by PIC value Repeatability within, and reproducibility across laboratories in terms of scoring data Known distribution of the markers throughout the genome (i.e. map position) The avoidance, as far as possible, a of markers with “null” alleles

II. UPOV의 분자표지 활용 논의 동향 1. BMT 가이드라인 ◎ DNA profile database 구축 방법 데이터베이스 포함 내용: Species, Variety, Technique, Marker, Locus, Allele, data

II. UPOV의 분자표지 활용 논의 동향 2. BMT-DUS 문서 제정(2011) ◎ 목적 DUS 검정에 DNA 마커 활용에 대한 기준 제시 ◎ 내용 Option 1~4 제안

II. UPOV의 분자표지 활용 논의 동향 2. BMT-DUS 문서 ◎ DUS 검정에 분자표지의 활용 분야 Option 1 : 형태적 특성과 연관된 분자표지를 활용 Option 2 : 표현형과 유전자형의 상관관계가 높을 때 기존품종의 관리와 대조품종 선정에 활용 가능한 차원에서 분자표지를 활용 Option 3 : 분자표지만으로 품종의 구별성을 판단 ☞ 형태적으로 차이가 없거나 미세한 차이가 나는 품종에 대해서도 구별성을 인정할 수 있어 의견 불일치 Option 4 : 형태적 특성과 분자표지를 모두 활용하여 기존품종 관리에 활용

II. 국외의 분자표지 활용 논의 동향 2. BMT-DUS 문서 ◎ Option 1 : 형태적 특성과 연관된 분자표지를 활용 <보리 169품종의 DUS 특성과 96개 SNP 마커 검정 결과의 정확도> 제안국 : 영국(NIAB) - 보리의 파성과 연관된 SNP 마커를 DUS 검정에 직접 활용 가능성 제시 - 보리의 DUS 특성조사에 활용되고 있는 종자 호분층의 색깔 등 28개 특성과 관련된 96개의 SNP 마커를 활용 제안국 : 네덜란드(Naktuinbouw) - 상추 노균병 저항성 연관 마커 - 토마토 병 저항성 연관 마커 BMT/13/17

II. 국외의 분자표지 활용 논의 동향 2. BMT-DUS 문서 ◎ Option 2 : 표현형과 유전자형의 상관관계가 높을 때 기존품종의 관리와 대조품종 선정에 활용 가능한 차원에서 분자표지를 활용 작물 분자표지수, 품종수 연구결과 문헌 유채 23개 SSR, 410품종 상관관계가 낮음 BMT/9/8, BMT/10/11, BMT/11/11 장미 11개 SSR, 734품종 BMT/9/12, BMT/10/16 감자 12개 SNP, 305품종 BMT/9/13, BMT/11/9, BMT/11/10 오이 11개 RAPD, 41품종 r=0.65 Bernet et al. 2003 밀 234개 AFLP/70개 SSR, 58품종 AFLP 마커와 표현형의 r=0.46 SSR 마커와 표현형의 r=0.56 Maccaferri et al. 2007 완두 10개 SSR 등, 25품종 r=0.16 Smykal et al. 2008 옥수수 28개 SSR, 41품종 r=0.21 Gunjaca et al. 2008 청경채 9개 SSR, 8품종 r=0.41 Yim et al. 2009

II. 국외의 분자표지 활용 논의 동향 2. BMT-DUS 문서 ◎ Option 4 : 형태적 특성과 분자표지를 모두 활용하여 기존품종 관리 제안국 : 프랑스(GEVES) 내용 : 옥수수의 형태적 특성과 분자표지를 활용하여 기존품종 관리 - 형태적 특성 : 품종간의 각 특성에 대한 거리를 합계하여 표현형 거리 산출 - 분자표지 : 60개 분자표지에 의한 유전적 거리 산출 - 형태적 특성의 threshold와 분자표지의 threshold를 고려한 다음, threshold 이상의 명백한 구별성이 나타나는 품종은 재배시험 생략

II. 국외의 분자표지 활용 논의 동향 ◎ 주요국의 품종식별 분자표지 개발 및 활용 현황 스페인 (GESLIVE / IRTA) 네덜란드 (Naktuinbouw) 프랑스 (GEVES) 작물 작물 : 복숭아, 체리, 올리브, 딸기, 블루베리, 카네이션, 장미, 고추, 가지, 토마토, 멜론 등 DB 구축 작물 : 복숭아, 카네이션, 밀, 포도, 딸기, 자두 등 작물: 토마토, 팔레놉시스, 상추, 콩, 브로콜리, 당근, 양파, 고추, 양배추, 수박, 감자, 딸기, 사과, 칼랑코에, 제라늄, 프리지아, 장미, 카네이션, 안스리움, 거베라, 수국, 백합, 안개꽃, 참나무, 피나무 등 작물 : 상추, 복숭아, 옥수수 등 DNA 마커 종류 SSR AFLP(28작물), SSR(5작물) 연구 분야 Option1, 품종식별 Option1, Option2, 품종식별 Option4, 품종식별 활용 분야 기본유래품종식별 품종동일성 확인 품종보호 침해 법원 감정시험 증거자료로 활용 품종보호침해(Variety Tracer) 활용 (21작물, 2006~2011년) F1 종자 순도검정 기존품종 관리

(Canadian Grain Commission) (농림수산성/종묘관리센터/농업식품산업기술연합기구) II. 국외의 분자표지 활용 논의 동향 ◎ 주요국의 품종식별 분자표지 개발 및 활용 현황 영국(NIAB/SASA) 캐나다 (Canadian Grain Commission) 일본 (농림수산성/종묘관리센터/농업식품산업기술연합기구) 중국 (북경옥수수 연구소/국립벼연구소) 작물 작물 : 보리, 유채, 감자 등 작물 : 밀, 보리 작물 : 밤, 배, 사과, 딸기, 복숭아, 체리, 자두, 살구, 감귤, 밤, 포도, 차 등 작물 : 옥수수, 벼 등 DNA 마커 종류 SNP, SSR SSR, SNP SSR, CAPS, SNP 연구 분야 Option1, Option2, 품종식별 품종식별 활용 분야 DUS 검정 순도 검정 품종보호침해(G-Man) 국경검색 F1 순도검정 품종보호침해 다명칭 품종식별

III. 종자원의 품종식별 분자표지 개발 현황 ◎ 종자원 품종식별 분자표지 개발 현황 및 방향 대상작물 : 출원품종수가 많고 분쟁의 가능성이 높은 작물 - 채소 : 고추, 배추, 무, 참외, 멜론 등(2002년~) - 과수 : 복숭아, 사과, 블루베리 등(2008년~) - 화훼 : 장미(2009년~) - 버섯류 : 느타리(2011년~) 분자표지 : SSR 분석법 활용 - 논문에 공개된 SSR 프라이머 정보 활용 : 시간과 비용 절감 - 공개된 마커 정보가 없는 경우는 SSR 마커 신규 개발

III. 종자원의 품종식별 분자표지 개발 현황 ︿ ︿ ◎ SSR 마커를 이용한 DNA 프로파일 데이터베이스 구축 절차 시료준비 분쇄 DNA 분리 및 정량 PCR reaction PCR Agarose gel 전기영동 <핵산 단편 크기의 정확도> <용도> 마커 선발용 DB 구축용 ① PAGE gel 전기영동 ︿ DNA 프로파일 DB 구축 품종에 따른 핵산 단편의 크기를 정확하게 측정하여 수치화한 자료 ② Capillary gel 전기영동 유전적 유사도 분석 ︿ ③ 자동염기서열분석기 전기영동

III. 종자원의 품종식별 분자표지 개발 현황 ◎ DB 구축 현황(23작물): 채소 13, 과수 4, 화훼 1, 식량 4, 버섯류 1 (‘14년 5월) 구분 작물명 활용기법 품종수 채소 고추 SSR 672 과수 복숭아 174 수박 300 사과 67 멜론 180 블루베리 40 토마토 122 감귤 113 양파 77 자두 마커 선발완료 (‘14년 DB구축중) 딸기 110 배추 435 화훼 장미 70 국화 마커 선발중 (‘14년 DB구축예정) 참외 108 식량 작물 벼 373 당근 22 SNP(농관원마커 활용) 78 호박 167 보리 71 무 288 콩 148 상추 171 옥수수 90 오이 175 버섯류 느타리 69 계(23작물) 4,120품종

III. 종자원의 품종식별 분자표지 개발 현황(화훼작물) ◎ 장미 품종보호 등록된 품종수: 769품종(‘14년 5월) 유전자 분석 품종수: 70품종(품종보호 출원 및 대조품종 활용) SSR 마커: 112개의 SSR 프라이머 대상 품종식별력 검정 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 C187 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 CL2845 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Rw62D8 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 H22C01 <PAGE gel을 이용한 마커 선발>

III. 종자원의 품종식별 분자표지 개발 현황(화훼작물) ◎ 장미 22개 SSR 마커를 이용하여 70품종에 대한 DNA 프로파일 DB 구축 SSR marker Repeat motif Annealing temp (℃) Product Size(bp) No. of alleles PIC value Primer labeling C187 (AAG)7 55 200~228 6 0.711 VIC CL2845 (AAG)17 292~303 5 0.650 NED H22E04 241~250 4 0.658 FAM Rw54N22 (TC)9x(TC)8 211~223 0.700 PET Rw62D8 CT rich 246~276 3 0.665 C172 (AAG)8 144~150 0.630 CL2002 (TCAT)4 186~204 8 0.733 H22C01 (TC)9 218~246 0.702 Rh48 (AGG)5 247~250 2 0.497 Rh93 (TTC)9 203~221 0.627 H1F03 (TG)9 151~161 0.401 Rw16E19 (CT)14 204~208 0.473 Rw20I17 (CT)16 185~229 9 0.753 Rw23F13 (TTC)7 197~223 7 0.804 Rw34L6 (AG)9x(AG)8 248~262 0.693 Rw52D4 (AG)16 215~239 0.595 Rw35C24 (CT)10 241~253 0.211 CL2980 (CT)11 208~220 0.697 H20D08 163~183 10 0.813 H23O17 (AAG)6 223~233 0.638 Rw55E12 - 127~144 0.534 H9B07 239~269 0.467 Total 114 13.652 Mean 5.18 0.621

III. 종자원의 품종식별 분자표지 개발 현황(화훼작물) ◎ 국화 품종보호 등록된 품종수: 588품종(‘14년 5월) 유전자 분석 품종수: 20품종(국내 주요 유통품종 활용) SSR 마커: 426개의 SSR 프라이머 대상 품종식별력 검정 <Capillary gel을 이용한 마커 선발> <NGS(Ion torrent) 분석기> 차세대염기서열분석기법을 이용한 신규 마커 개발중 Next-Generation Sequencing(NGS): DNA 염기서열 정보를 저비용, 고속, 대용량으로 분석하는 기술

IV. 품종보호제도 강화를 위한 유전자 분석 기술의 활용 사례 ◎ 종자관리에 유전자 분석 기술의 활용 분야 유전자 분석 기술 품종보호 재배심사 분쟁종자 대비시험 품종보호 등록품종 특성유지 확인시험 식량 작물 순도 검정 침해시험 유통종자 품종진위 검정 (2005년~현재) 19건 (2008년~현재) 24건 (2010년~현재) 69건 (2012년~현재) 4건 (2007년~현재) 50건 5건 시험분석 신청 수수료: 품종당 30만원 분쟁조정 신청 수수료: 품종당 30만원

대조품종 선정 체계 구축 IV. 품종보호제도 강화를 위한 유전자 분석 기술의 활용 사례 ◎ 품종보호제도에 분자표지의 실용적 활용 연구 방향 Option2 를 변형하여 품종보호에 실용적으로 활용 가능한 방향 연구 작물별 다수의 분자표지 개발 EST 유래 마커 적극 활용 작물별 DNA D/B 구축 DNA 분석담당자 출원, 대조품종 분석 기존 DB 품종과의 유전적 유사도 설정 재배시험담당자 유전적 유사도가 높은 품종을 대조,참조 품종으로 활용 대조품종 선정 체계 구축 Pre-screening system 공동 검증 DNA 및 재배시험 결과의 과학적 재검증

IV. 품종보호제도 강화를 위한 유전자 분석 기술의 활용 사례 ◎ 품종보호 재배심사에 분자표지의 실용적 활용 사례 품종보호 출원품종의 대조품종 선정에 활용 년도 작물수 작물명 2010 4 수박, 오이, 배추, 복숭아 2011 9 고추, 수박, 참외, 오이, 배추, 콩, 무, 양파, 벼 2012 14 고추, 토마토, 수박, 참외, 오이, 멜론, 배추, 무, 상추, 양파, 복숭아, 사과, 보리, 벼 2013 13 고추, 토마토, 수박, 참외, 오이, 멜론, 배추, 무, 상추, 양파, 콩, 벼, 복숭아, 사과 2014 16 벼, 무, 배추, 수박, 토마토, 멜론, 참외, 고추, 콩, 오이, 상추, 감귤, 장미(완료) 복숭아, 사과, 블루베리, 보리(분석 예정) 품종보호 출원품종의 구별성, 균일성, 안정성 확인 보조자료로 활용 - 구별성 : 배추, 블루베리 - 균일성 : 콩, 고추 - 안정성 : 토마토, 보리, 콩

IV. 품종보호제도 강화를 위한 유전자 분석 기술의 활용 사례 ◎ 출원품종의 대조품종 선정 : 수박, 오이 출원 대조 대조 출원 <사진출처 : 서부지원> <사진출처 : 경남지원>

IV. 품종보호제도 강화를 위한 유전자 분석 기술의 활용 사례 ◎ 출원품종의 대조품종 선정 : 상추 출원품종 유전자 분석 결과 출원품종과 가장 유사한 품종 유사품종과의 유전적 유사도 A 썬레드버터 84.8% B 선망적축면,레드퀸적축면 86.7% C 장풍적축면 80% D 선풍2호, 넘버원 98% E 유사한 품종이 없음 - F 써니레드버터 G 오향적치마, 보배적치마 79.7% H 여름개량담배 73.6% 출원품종 대조품종

IV. 품종보호제도 강화를 위한 유전자 분석 기술의 활용 사례 ◎ 출원품종 대조품종 선정 : 복숭아 천도 백도 <사진출처 : 서부지원> 출원 대조

IV. 품종보호제도 강화를 위한 유전자 분석 기술의 활용 사례 ◎ 출원품종 대조품종 선정 : 감귤 온주밀감 오렌지 기본유래품종의 경우 분자표지에 의한 품종식별이 어려움 예) 돌연변이, 아조변이 육성품종 출원품종 유전자 분석 결과 출원품종과 유사한 품종 유사품종과의 유전적 유사도 A 하례조생 등 20품종(계통도 참조) 100% B 탐나조생 등 20품종(계통도 참조) C 부지화

IV. 품종보호제도 강화를 위한 유전자 분석 기술의 활용 사례 ◎ 출원품종 구별성 확인 : 블루베리 하이부쉬 하프 하이부쉬 래빗아이 I : Vaccinium corymbosum, II : Vaccinium corymbosum x Vaccinium angustifolium, III : Vaccinium ashei : 출원품종

IV. 품종보호제도 강화를 위한 유전자 분석 기술의 활용 사례 ◎ 출원품종 균일성 확인 : 고추, 콩 작물명(당조) 종자 출처 개체수 고추(당조) 품종보호 48 생산판매신고 24 유통종자 작물명 품종명 개체수 콩 중모3001 24 중모3002 12

IV. 품종보호제도 강화를 위한 유전자 분석 기술의 활용 사례 ◎ 출원품종 안정성 확인 : 보리 품종명 연차 분석점수 대안찰 2 12 3 자수정찰 보석찰 중모2001

IV. 품종보호제도 강화를 위한 유전자 분석 기술의 활용 사례 ◎ 품종보호 등록품종의 특성 유지확인에 분자표지 활용 사례 관련 근거: 식물신품종보호법 제82조(보호품종 유지 의무) 연차적으로 작물을 선정하여 유전자 분석 및 재배시험 실시 (’12) 벼 → (’13) 고추, 콩 → (‘14) 배추 작물 벼 고추 콩 배추 유전자 분석 품종수 164 73 103 64 유전자 분석 방법 SSR 유전자 분석결과 8품종 상이 6품종 상이 2품종 상이 9품종 상이

IV. 품종보호제도 강화를 위한 유전자 분석 기술의 활용 사례 ◎ 품종보호 침해시험에 분자표지 활용 사례 : 참외, 수박, 벼 연도별 분석 건수: 2 (’05) → 1(’08) → 1(‘09) → 1(’11) 재배시험 유전자 분석

V. 향후 계획 ◎ 품종보호 출원품종 재배심사에 유전자 분석 기술의 융·복합 활용 품종보호 출원품종의 재배심사 분야: 대조품종 선정, DUS 검정 보조자료 품종보호 등록품종의 특성유지 확인 시험: 보관 및 제출종자간 상이한 품종 확인 ◎ 화훼작물의 품종식별 분자표지 개발 및 품종식별 DB 구축 확대 신규작물 DB 구축 : 국화(2014), 거베라(2015) 화훼작물의 품종보호 등록 및 생산판매수입신고 건수 품종보호 등록 품종수 생산판매수입 신고 건수 1 장미(769) 백합(1,723) 2 국화(588) 거베라(1,079) 3 거베라(153) 장미(625) 4 백합(146) 팬지(609) 5 심비디움(88) 국화(601) (국립종자원, 2014)

V. 향후 계획 ◎ 차세대염기서열분석기를 활용한 유전자 분석 기법 개발 ◎ 영양체 시료의 DNA 보관체계 구축 대상작물 : 블루베리, 국화, 거베라 등 분석기법 : NGS 분석을 활용한 SSR, SNP 마커 신규 개발 ◎ 영양체 시료의 DNA 보관체계 구축 대상품종 : 품종보호 출원품종 등 품종의 진위가 확실한 품종 대상 작물 및 품종별로 바코드화하여 -70도 보관 ◎ 작물별 형태적 특성 및 DNA 검정에 의한 품종특성의 국가표준 DB 구축 연구과제 추진(2013년 12월~2016년 12월) 산학연 전문가 등과 공동연구 추진 → 정밀도 높은 국가표준 DB 구축 작물별 형태적 특성 DB 구축: 12작물 작물별 DNA Profile DB 구축: 13작물

V. 향후 계획