Centrifugal Partition Chromatography and Preparative HPLC Bene Technology MKT

분석과 분취 공통점 ? 차이점 ? 최신 PREP LC 시료 전처리 PREP 제안 1/2/3/4 기타 : Separation, 시료 전처리 차이점 ? : 시료량, Data or Purified Target, 시료 전처리 과정, … 최신 PREP LC 시료 전처리 PREP 제안 1/2/3/4 기타 : 분리정제 최적화, DAC, CPC요약

3. Prep HPLC 구조 이해/연구용 Man Inj. Makeup Pump Mass Spec UV/Vis Detector /Gradient, Diluent Column Man Inj. ELS Auto Injector Auto Fraction. waste Split Kit

3.2 용액 희석 주입의 장점 : Injection Volume Effect 피크 폭 vs 시료 주입량mg 컬럼 : 10x100mm YMC ODS 유속 : 8ml/m 성분 : 0.1% Cortisone, 10mg/ml ACN 자동 희석 주입 0.2/0.5/1/2/3/4 ml 원액 주입 0.2/0.5/1 ml

3.2 용액 희석 주입의 장점 : Loading Capacity vs Selectivity 피크 폭 vs 시료 주입량mg 컬럼 : 4.6x100mm ODS 유속 : 3ml/m 성분 : 0.1% Cortisone, 10mg/ml ACN Loading Capacity => Matrix Effect 자동 희석 주입 0.2/0.5/1/2/3/4 ml 자동 희석 주입 0.2/0.5/1 ml Cortisone : 360.46 Furosemide : 330.745

4. 시료 전처리 의 종류 및 분리원리 시료 전 처리는 Sample/Sample Matrix을 Clean-Up하고 Target을 사전에 농축하는 과정으로 노동력과 시간이 많이 소요됩니다. 최종 분석이나 분취를 위한 컬럼과 장비를 보호합니다. Precipitation : Solubility LLE : Partitioning in one of two liquid phases SPE : Adsorption/partitioning onto solid sorbent Dialysis/ultrafiltration : MW/size Electrophoresis : Charge Distillation/Evaporation : Boiling point/vapor pressure Supercritical Fluid Extraction : Partitioning into supercritical fluid

4.1 시료 전 처리 과정 PPT LLE SPE(SLE) 1. 용액화 : 극성/비 극성 용매, 휘발성/비 휘발성 buffer 2. Particle 제거 - Ultracentrifugation : 5,000-10,000 rpm 이상 - Filter : 지용성, 수용성 filter 3. Target Chemical PPT LLE SPE(SLE)

4.1 시료 전 처리 과정 : LLE vs SPE LLE과정 SPE과정 빠른 시료 처리 높은 회수율/ 정확성 시료 전 처리 과정 최소화 불안전한 시료로 인한 위험성 감소 자동화

4.1 시료 전 처리 과정 : SPE의 ANB 전처리 예 시료 Acidic Water soluble Neutral MeOH soluble Basic SPE SAX- Hydrophobic Liphophilic-Hydrophilic SCX- Hydrophobic Condition MeOH 0.1% acetic acid Equilibrate : 1ml/mn이하 Water 1% acetic acid Load =>dry Water Buffer(Ph7) Internal std Wash1 10mM ammonium acetate in 5-10% MeOH 5-10% MeOH 1% Acetic acid Wash2 Elute =>Dry reconstitution 0.1% formic acid 2-3% NH4OH 일반 process

4.2 SPE 의 종류 예 Reverse Phase • Nonpolar Interactions • Van der Waals Forces • / Interactions • Secondary Interactions Normal Phase • Polar Interactions • Hydrogen Bonding • Dipole-Dipole Interactions Ion Exchange • Cationic Interactions • Anionic Interactions Mixed Phases • Combine Ionic Non-polar and Polar Interactions -Si-O-C (CH2-CH-CH2)n -Si-OH -Si-CH2-CH2-CH2-CN -(NR )+ 3 NH2 - COO C -SO3 Si-O-C Si-O-Si-C SO3 Silica CN C18 C8 C2 Phenyl SAX/WAX SCX/WCX SDB-RPS SDB-SCX

4.3 SPE의 선택 GUIDE 용해도 수용성 지용성 용매 이온성-Buffer 비 이온성-Ion Paired MeOH ACN THF EtOAc AH2Cl2 Et2O C5 C6 iC8 충전물 음이온 양이온 Polar 중간극성 Non-polar polar 모드 AEX CEX NPC LSC RPC Polymer Phase MAX MCX OPT HLB DVB Silica SAX WAX SCX WCX CN DIOL NH2 C18,8,2 Phenyl Non Silica Florisil, Alumina A/B/N, Carbon Specialty EVIDEX for DOA

Steric(Entropic) Interaction Adsorption(Energetic) Interaction 5.1 Column Chemistry Vt = Vo + Ve Injection Vo VE VR Log M Retention Time GPC/GFC Steric(Entropic) Interaction HPLC(RPC, NPC, IEX,..) Adsorption(Energetic) Interaction

5.1 Prep 1 : GPC_HPLC 2D 1. Pre-Prep - GPC : 지용성 시료 - GFC : 수용성 시료 2. Fine-Prep - RPC : Acidic/Basic Polar - NPC : Non Polar, HILIC (Aqueous NPC) - IEC : Ionic

5.2 CPC Chemistry LLC의 개념 소형화 다 단계 분리 LLC의 고정상 화? [A] [B] [A] LLC의 개념 Partition Coefficient aA= [A] upper phase/[B] lower phase

5.2 CPC 구성

5.2 CPC 응용 예 1 Isolation of tea catechins by CPC technology Solvent system: Chloroform/methanol/n-propanol/water Purity was determined by HPLC

5.2 CPC 응용 예 2 Isolation of Ginsenosides by CPC technology Solvent system: Ethyl acetate/1-butanol/water Purity was determined by TLC

5.2 Prep 2 : CPC_HPLC 2D 1. Pre-Prep - CPC : 지용성 시료, 수용성시료 2. Fine Prep - RPC : Acidic/Basic Polar - NPC : Non Polar, HILIC (Aqueous NPC) - IEC : Ionic

5.3 Prep 3 : Recycle 1. GPC Recycle Prep - HPLC System Recycle 2. Valve Recycle Prep - Clean Recycle

5.4 Prep 4 : Scale up 1. Pre-Prep을 실시한다. 2. Scouting with Analytical Column - 분리 능이 좋고 분석시간이 짧은 컬럼으로 분리한다 - Gradient, Ph , 용매 조성 등을 최적화하고 - 최소 분석시간, 최대 시료 주입량을 확인한다 3. Scale up - Scale Factor = Prep Column Volume/ Anal Column Volume - Prep mass weight = Anal mass weight X SF - 유속 : - Gradient 시간 : 4. 기타 - Particle Size 조정

6.1 분리정제의 최적화 과정 분리 mode의 선택 3요소 2. 컬럼의 Dimension 선택 - Resolution : Impurity 제거 능력, 필요 시 2D separation - Load Capacity : 주 성분의 처리능력 - 분석시간 : 1일 생산량 = 분취량/Injection x 주입회수/day 2. 컬럼의 Dimension 선택 - 컬럼 ID : 1회 시료 주입량은 컬럼 단면적에 비례 - 충전물 Particle size : 작은 충전물은 분리 능은 증가 압력은 증가 큰 충전물은 분리 능은 감소 압력은 감소 - 컬럼 Length : 긴 컬럼은 분리능 증가 시료주입량 증가 압력증가 분석시간 증가

6.1 분리정제의 최적화 과정 3. Scale Up Strategy O Target Amount 응용 영역 ug level Enzyme 분리 등 mg level Biological/biochemical testing 구조 및 특성 연구 : 생산공정 불순물, 대사체, 천연물 g level STDs제조 독성연구 : 고 순도 주 성분, side product kg level 산업 생산, 상품화(Drug, 활성물질 등) High 분리능, 압력, 비용 Low 표준 주입량 PS um ID(이론단수) Spherical Irregular 5(9만) 10(4만) 15(2만) 20(만) 50(5천) 230/70mesh 연구분야 4.6, 6.0 O 수십 mg 10, 20 수백 mg 50 수 g 100, 150 수십 g 200 수백 g 300 이상

6.2 Dynamic Axial Compression Column : YMC

6.3 CPC prep 요약 주요 응용산업 분야 : Nutraceutical, Fine Chemicals, Pharmaceutical, Bio-Medical, Biotechnology, Fats and Oils, Fermentation 주요 성분 Saponins, Alkaloids, Chlorophylls, Tannins, Carotenoids, Phospholipids, Fat soluble vitamins, Mono/Oligo-saccharides, Anthocyanins, Lignans, Phenolic compounds, Synthetic Compounds, Other active compounds present in plants(e.g., herbs and spices) AND protein/peptide… CPC system Column Volume (ml) Partition Cell (개) 분리유속 분리 시 일반 Rotation Speed 시료 주입량 (이론 치 1%,g) CPC 80 80 712 5-10 ml/mn 1500 0.8 CPC240 240 2,136 5-20ml/mn 2.4 CPC1400 1,400 1,296 25-50ml/mn 1100 14 CPC5400 5,400 1,040 100-200ml/mn 1000 54

6.3 CPC prep 요약