제6주. 광합성 색소분리 및 측정 2010. 4 생물학 실험
종이 크로마토그래피를 이용하여 시금치 잎에서 광합성 색소를 분리하고 색소의 빛 흡수를 알아본다. 1. 실험목적 종이 크로마토그래피를 이용하여 시금치 잎에서 광합성 색소를 분리하고 색소의 빛 흡수를 알아본다. 분광광도기(spectrophotometer)를 이용하여 색소의 최대흡수 파장을 알아본다 2. 실험원리 6CO2+12H2O→C6H12O6+6H2O+6O2 1) 광합성 색소 주색소 : chlorophyll a, chlorophyll b 보조색소: carotenoid b-carotene, xanthophyll, lutein, lycopene… 2) 종이크로마토 그래피 고정상 (여과지 표면에 흡착되어 있는 물) 과 이동상 (전개액으로 사용되는 유기용매) 혼합물은 여과지를 이동할 때 물과 전개액에 녹는 비에 따라 이동 속도차이
시금치 잎, 여과지, 가위, 모세관, 시험지, 고무마개, 핀, 막자사발, 실험기구 및 재료 시금치 잎, 여과지, 가위, 모세관, 시험지, 고무마개, 핀, 막자사발, 전개용매(석유에테르:아세톤=9:1), 아세톤, 자, 시험관 꽂이, spectrophotometer, cuvette, 원심분리기 실험 방법 가. 광합성 색소의 분리 일정량의 시금치 잎(약5g) 을 아세톤 5mL에 넣고 막자 사발로 곱게 간다. 이 추출물을 탁상용 원심분리기를 이용하여 원심 분리하여(2000rpm에서 5분간) 상등액을 취한 후 침전물을 아세톤 5mL에 다시 현탁시켜 막자 사발로 갈고 원심분리한 후 상등액을 위의 상등액과 합친다.
나. 종이 크로마그래피를 이용한 엽록체 색소분리 실험 방법 나. 종이 크로마그래피를 이용한 엽록체 색소분리 a. 여과지를 15x2cm 크기로 자른다. 한쪽 끝에서 1cm 되는 곳을 잘라 삼각형을 만든 다음 이곳으로부터 2cm 되는 곳에 연필로 선을 긋는다. (여과지는 절대 손으로 만지지 말것) b. 연필로 그은 부분에 동전이나 자를 이용하여 식물의 잎을 밀면서 즙액을 묻힌다. 완전히 말린 후 4~5회 정도 반복하여 점적한다. c. 핀으로 여과지를 시험관 마개에 매달고 전개용매가 들어 있는 시험관에 넣는다. (여과지가 시험관 벽에 닿지 않도록 주의하고 전개 용매에 용지의 끝이 0.5cm만 잠기게 한다. 여과지는 맨손으로 만지지 않으며 마개를 완전히 닫을 것(전개용매 증발방지)) d. 전개용매가 크로마트그래피 용지에 전개되는 상황을 지켜보면서 5분 이상 색소의 이동이 보이지 않으면 전개를 멈춘다. e. 크로마토그래피 용지를 꺼내서 전개된 부분을 연필로 표시한 후 여과지를 말린다.
나. 종이 크로마그래피를 이용한 엽록체 색소분리 실험 방법 및 결과정리 나. 종이 크로마그래피를 이용한 엽록체 색소분리 점적한 부분에서 가장 가까운 곳의 노란색을 띤 녹색의 밴드가 chl b이고, 그 위에 푸른색을 띤 녹색 밴드가 chl a이며, 그 위쪽으로 몇 개의 Carotenoid 밴드가 나타난다. 각각 밴드의 Rf 값을 다음의 식으로 구한다. Rf = 특정 색소가 이동한 거리/ 전개액이 이동한 거리 광합성 색소 이동거리(mm) 전개율(Rf값) 비고(밴드의 색) 전개용매 Carotenoid II Carotenoid I Chl a Chl b
나. 종이 크로마그래피를 이용한 엽록체 색소분리 실험 방법 및 결과정리 나. 종이 크로마그래피를 이용한 엽록체 색소분리 다른 색소 밴드가 섞이지 않도록 주의하며 엽록소a 밴드를 잘라 내어 시험관에 넣고 아세톤 10mL를 부어 유리막대로 잘 저어 준다. Spectorphotomter를 이용하여 380nm에서 700nm까지의 파장에서 흡광도를 측정한 후 최대 흡수 파장을 알 아본다. 동일한 방법으로 다른 색소의 최대흡수 파장도 알아본다. 파장 흡광도 420nm 580nm 460nm 620nm 500nm 660nm 540nm 700nm
Colour and Form of Pigments That Constitute Chlorophyll Colour and Form of Pigments That Constitute Chlorophyll Name of pigment Colour Carotene Orange Xanthophyll Yellow Chlorophyll a Blue - Green Chlorophyll b Yellow - Green