Department of Chemical Engineering Kangwon National University Biochemical Engineering Jung-Won Kim Department of Chemical Engineering Kangwon National University J

Chapter 3 Enzyme Kinetics

Contents 1 2 3 4 Introduction Rxn Rate Expression Enzyme Rxn Kinetics Effects of pH, Temperature, and Concentration 4

1-1. Chemical Rxn Rate Chemical (Reaction) kinetics The part of physical chemistry that studies reaction rates (The concepts of chemical kinetics are applied in many disciplines, such as chemical engineering, enzymology and environmental engineering) The reaction rate (rate of reaction) for a reactant or product in a particular reaction is intuitively defined as how fast or slow a reaction takes place - For example, the oxidation of iron under the atmosphere is a slow reaction which can take many years, but the combustion of butane in a fire is a reaction that takes place in fractions of a second Chemical rxn rate: 단위부피당 단위시간에 소모되는 반응물 성분 A의 몰농도로 정의(mol/m3·s)

1-1. Chemical Rxn Rate Chemical rxn rate ( ) 음의 부호(-): 반응물 소모를 기준으로 나타낼 경우 반응이 진행됨에 따라 반응물의 농도가 감소 반응속도 = 반응물의 소실속도 -rA = -dCA/dt CA : 반응물 A 농도 t : time r = kf(Ci): 각 성분의 농도에 의존하는 함수 (k: rxn rate constant, 온도에 의존)

1-2. Rxn Order Reaction order (α + β 차수) For a chemical reaction aA + bB → cC + dD, the rate equation or rate law is a mathematical expression used in chemical kinetics to link the rate of a reaction to the concentration of each reactant. : 위 반응속도식에서 α와 β는 반응속도가 반응물 A와 B의 농도에 따라 각각 어떻게 변하는가를 나타내는 것 - α & β : 시간과 농도에 무관한 상수 (실험적으로 결정되며 a, b와 무관)

1-2. Rxn Order Reaction order (α + β 차수) For example, Ascobic acid + O2 → dehydroascobic acid + H2O2 : -rA = kCACO2 반응차수 - 실험적으로 결정되는 값 - 반응 속도식: 간단한 차수의 형태로 표시할 수 없는 복잡한 반응이 많음

Michaelis-Menten saturation curve of an enzyme reaction 1-2. Rxn Order Enzyme reaction order Michaelis-Menten 속도식: 기질의 농도(Cs)가 증가함에 따라 1차에서 0차로 변함 Michaelis-Menten saturation curve of an enzyme reaction S (Cs) : 기질(substrate)의 농도 Vmax : 최대 반응속도 KM : Michaelis-Menten constant (substrate concentration at which the reaction rate is half of Vmax )상수 Michaelis–Menten kinetics is one of the simplest and best-known models of enzyme kinetics. Named after American biochemist Leonor Michaelis and Canadian physician Maud Menten

1-3. Rxn Rate Constant Reaction rate constant (k) 온도에 따라 변할 뿐 아니라 반응에 사용하는 solvent, 촉매농도, pH 등 환경조건에 따라서 변한다. (그러나 일반적으로 다른 환경조건은 일정하다고 생각하고 k를 온도만의 함수) 온도에 따라 변할 뿐 아니라 반응에 사용하는 용매, 촉매농도, pH 등 환경조건에 따라서 변한다. 그러나 일반적으로 다른 환경조건은 일정하다고 생각하고 k를 온도만의 함수로 나타내는 경우가 많다. 속도상수의 단위는 총괄 반응차수에 의존. e.g.) 1차 반응의 경우 속도상수의 단위는 시간의 역수(sec-1)

2 Rxn Rate Expression

2. Rxn Rate Expression ~ A Simple Constant Volume Rxn System ~ Reaction rate equation -화학공정이나 생물공정 ~ 반응차수(대부분 0차 또는 1차) 비가역 1차 반응(irreversible first order reaction kinetics) - irreversible rxn: 생성물이 다시 반응물로 복귀되는 일이 없슴 - First order rxn: 반응속도가 한 종류의 반응물질의 농도에 비례 (unimolecular rxn) 0차 반응(zero order reaction kinetics) - 반응속도가 반응물의 농도에 전혀 영향을 받지 않는 반응 비가역 연속반응(irreversible serial reaction) - 여러 단계의 연속된 반응 (효소에 의한 생화학 반응은 대부분 연속 반응) - 반응물 (reactant), 중간 생성물 (Intermediate), 최종생성물 (product) 반응차수가 변동되는 반응속도식 - 반응물의 농도감소에 따라 낮은 차수에서 높은 차수로 이동하는 반응

2-1. Irreversible First Order Rxn Kinetics Irreversible first order reaction kinetics (비가역 1차 반응) Unimolecular rxn, A R by first order reaction, -rA = -dCA/dt = kCA 우측 두 항을 변수 분리하여 적분하면, 임의의 시간 t에 반응물 A의 농도(CA)를 구하는 식으로 표현하면, !! : A의 농도는 반응이 진행됨에 따라 대수 함수적으로 감소

2-1. Irreversible First Order Rxn Kinetics Irreversible first order reaction 에 대한 도시법 반응 속도 상수 (k) - 반응물 농도의 대수값과 반응시간 (t) 사이에 직선 관계 성립 - 실험에 의해 얻어진 농도(CA) 데이터로부터 구한 값 –ln CA/CA0 and Least square method에 의한 직선식을 구함. (기울기: k) Half life (t1/2) - 반감기는 반응물질의 농도(CA)가 초기농도(CA0)의 절반으로 감소하는데 걸리는 시간 (t1/2로 표시)

2-2. Zero Order Reaction Kinetics - 농도에 전혀 영향을 받지 않는 반응 우측 두 항을 적분하면, 0차 반응에 대한 도시법 (속도상수 k) - 농도와 시간 실험 data로부터 각 반응시간에서의 잔존 반응물의농도 CA를 시간 t에 대해 도시 (기울기: k) 화학반응은 초기에 반응물질의 농도(CA0)가 충분히 높을 때에는 0차 반응을 나타내다가, 농도가 어느 수준 이하로 감소하면 반응성이 농도에 의존하게 되어 반응차수가 증가하게 된다.

2-3. Irreversible Serial Reaction - reactant, Intermediate, product - 연속 단분자형 1차 반응 - 각각에 대한 반응식에 대하여, 반응물(A), 중간생성물(R) 및 최종생성물(S)의 농도들이 시간의 함수로 구해진다

2-3. Irreversible Serial Reaction (1) - (1)의 CA을 대입하면, 이 식을 다음과 같은 1차 선형 미분방적으로 나타낸다 1차 선형 미방을 풀면, 다음과 같은 일반해를 얻는다

2-3. Irreversible Serial Reaction (2) 이때, 초기 조건 CR(t) = 0 이므로, 상수 C 는 상수 C를 (2)에 대입하면, (3)

2-3. Irreversible Serial Reaction 전체 몰수 변화는 없으므로 양론으로부터 반응물, 중간생성물, 최종생성물 사이에는 다음 관계가 성립된다 (4) (1) 과 (3)을 (4)에 대입, 결과적으로, 최종생성물 S의 시간에 따른 농도변화를 아래와 같이구할 수 있다. (5)

2-3. Irreversible Serial Reaction 비가역 연속 1차 반응에 대한 전형적인 농도-시간 곡선: 반응물질(A)은 지속적으로 감소하며, 최종생성물(S)은 S형으로 증가 중간생성물(R)은 최대값을 갖는다 (dCR/dt =0) CR,max

2-4. 반응차수가 변동되는 반응속도식 반응차수가 변동되는 반응속도식 - 반응물의 농도감소에 따라 낮은 차수에서 높은 차수로 이동하는 반응 - 이 반응속도는 다음과 같이 표현(A R) 차수가 변동되는 반응곡선 - 고농도의 CA(또는 )에서 이 반응은 속도상수가 인 0차 반응 - 저농도의 CA(또는 )에서 이 반응은 속도상수가 인 1차 반응으로 바뀐다 - Langmuir-Hinshelwood 속도식 (Michaelis-Menten 식과 유사)

3 Enzyme Rxn Kinetics

3. Enzyme Rxn Kinetics 단일 기질-효소 촉매반응의 속도식은 Michaelis-Menten 속도식을 기본 효소 반응은 Heterogeneous rxn으로써, 효소속도론의 정성적인 특징은 Langmuir-Hinshelwood 속도론과 흡사 생물계에서는 다기질-다효소반응과 같은 보다 복잡한 효소-기질간 상호작용이 일어날 수 있다. 효소는 기질과 결합할 수 있는 활성부위의 숫자가 일정하기 때문에 높은 기질농도에서는 활성부위 모두가 기질과 결합하여 효소가 포화되는 상태가 된다. 효소 반응도론은 효소(E)-기질(S)의 복합체[ES] 형성단계의 가역반응과 ES 복합체의 비가역 해리단계의 2단계의 반응체계로부터 구할 수 있다.

3. Enzyme Rxn Kinetics Mechanistic Models for Simple Enzyme Kinetics The rapid equilibrium assumption (빠른 평형 가정) The quasi-steady state assumption (유사 정상 상태 가정)

3-1. Mechanistic Models for Simple Enzyme Kinetics 단순 효소속도론의 수학적 모형(Michealis-Menten Kinetics) - 빠른 평형 또는 유사 정상상태 를 가정하여, 효소 반응속도식을 유도할 때 초기 단계는 두 경우가 동일 1) 반응속도 v는 생성물의 생성속도 또는 기질의 소모 속도: 2) ES 복합체의 시간에 따른 변화속도: 1단계에서 E와 S의 반응에 의한 ES 복합체의 생성, ES의 분해에 의한 E와 S로의 역반응 및 2단계에서 ES의 분해에 의한 E와 P의 생성속도를 고려 (효소에 대한 보존식: ) - 복합체 [ES]의 농도를 측정하는 것은 어려우므로 빠른 평형이나 유사 정상상태를 가정하여 [ES]를 대신할 표현식을 찾는다

The rapid equilibrium assumption - 빠른 평형가정은 효소와 기질이 반응하여 ES 복합체를 형성하는 과정이 빠르게 도달한다고 가정한 것 - 정반응속도와 역반응속도가 동일하다고 하면, = Km’ Km’: Michaelis-Menten 속도 상수 효소가 보전된다면, 위 식에 대입하여 정리하면, (1)을 아래의 속도식 [ES]에 대입, ( )

The rapid equilibrium assumption ( ) - Km'은 최대 반응속도의 1/2의 속도에 해당하는 기질의 농도로서 기질과 효소의 친화도를 나타내고, Km'이 작다는 것은 효소의 기질에 대한 친화도가 높다는 것을 나타낸다

The quasi-steady state assumption - 반응 초기에는 효소농도에 비해 충분히 높은 기질농도를 유지 (대부분의 실험) - 이 경우, 효소의 농도([E0])가 충분히 낮기 때문에 이라 가정 위 식에 대입하여 정리하면, 이것을 아래의 속도식 [ES]에 대입,

The rapid equilibrium & quasi-steady state assumption 두 가지 가정 중에서 어느 것을 사용하던지 동일한 결과가 유도 기질의 농도가 효소촉매 반응속도에 미치는 영향

3-2. Experimentally Determining Rate Parameters Michaelis-Menten 속도식의 속도상수의 결정 효소에 의한 반응이 Michealis-Menten 속도식을 따르는지 여부를 확인하고 속도식 내의 상수인 Km과 Vm 값을 결정하기 위해 일반적으로 초기속도(initial velocity) 실험으로 실험결과를 얻는다. ( 초기 기울기) 초기 기울기 구하기

3-2. Experimentally Determining Rate Parameters Michealis-Menten 속도식 v = - Km v/[S]+ Vm [S]/v = 1/Vm [S]+ Km/Vm

3-3. Models for More Complex Enzyme Kinetics 알로스테릭 효소(allosteric enzyme) Michaelis-Menten 속도식은 효소 내에 기질을 결합하는 부위가 하나 있는 경우이다. 그런데 어떤 효소들은 하나 이상의 기질 결합부위를 갖고 있다. 이러한 효소의 경우에는 기질이 효소와 결합하면 다른 기질분자의 결합을 촉진한다. 이와 같은 현상을 알로스테리(allostery) 또는 협동결합이라 하고 조절효소(regulatory enzyme)가 이 현상을 따른다. Allosteric enzyme kinetics n : 협동계수(cooperativity coefficient) n＞1: 양성 협동상태(positive cooperativity) n=1: Michaelis-Menten 속도식

3-3. Models for More Complex Enzyme Kinetics Michaelis-Menten 속도론과 알로스테릭 효소의 속도론을 비교 알로스테릭 효소는 v가 [S]에 대하여 S자 모양의 형태를 보여 준다

3-4. Inhibited enzyme kinetics 효소 저해제 (Enzyme inhibitors) - 어떤 물질은 효소와 결합하여 효소의 활성도를 감소시킨다. 이와 같은 물질을 효소 저해제(enzyme inhibitors)라 한다. 저해반응에서의 효소 속도론 효소반응은 저해물질이 있는 경우 그 속도가 느려진다. Three inhibited enzyme kinetics - 저해제가 기질과 유사하여 효소와 경쟁적(competitive)으로 결합 - 기질과 유사성이 없이 효소 또는 효소-기질복합체(ES) 구별 없이 무차별적으로 결합하는 비경쟁적(uncompetitive) 저해 - 저해제가 효소와는 결합하지 않고 복합체 ES와 반응하는 반경쟁적(noncompetitive) 저해 (e.g. Allosteric enzyme kinetics)

3-4-1. Competitive Inhibitor - 경쟁적 저해제는 보통 기질유사체(substrate analogs)이며 효소의 활성부위에 기질과 경쟁적으로 결합한다 Rapid equilibrium approach (빠른 평형 가정), 이 때의 효소의 속도식은, K'm,app = Km'(1+[I]/K1)이라 놓으면,

3-4-1. Competitive Inhibitor K'm,app = K'm (1+[I]/K1), 경쟁적 저해반응에 의한 실제 효과: K'm이 K'm,app로 증가함에 따른 반응속도의 감소 경쟁적 저해반응은 기질농도를 높임으로써 극복된다 위의 속도식에서 대괄호 안의 값이 1이면 Michaelis-Menten식과 동일함 By Lineweaver-Burk graph method,

3-4-2. Noncompetitive Inhibitor - 비경쟁적 저해제는 효소의 활성부위가 아닌 다른 부위에 결합하여 기질의 효소에 대한 친화성을 감소시킨다 Rapid equilibrium approach (빠른 평형 가정), = [EI][S]/[ESI] = [ES][I]/[ESI] [E0]= [E]+[ES]+[EI]+[ESI] 이 때의 효소의 속도식을 전개하면, Vm,app = Vm/(1+[I]/K1)이라 놓으면,

3-4-2. Noncompetitive Inhibitor Vm,app = Vm/(1+[I]/K1) 분모의 첫째 항에서 [I]/K1이 없는 경우에 Michaelis-Menten식 동일 비경쟁적 저해반응의 실제 효과는 Vm의 감소이다. (기질의 농도를 높이는 방법으로는 비경쟁적 저해반응을 극복할 수 없다.) 효소에 대한 비경쟁 저해의 결합을 방지하기 위해서는 다른 화합물을 첨가하여야 한다. 또 다른 비경쟁적 저해반응의 형태는 Vm의 감소와 동시에 Km'을 증가시키기도 한다. (이와 같은 현상은 ESI 복합체가 산물을 생성하는 경우에 나타난다.) By Lineweaver-Burk graph method,

3-4-3. Uncompetitive Inhibitor 반경쟁적 저해제(noncompetitive inhibitor)는 ES 복합체에만 결합하고 효소와는 친화력이 無! Rapid equilibrium approach (빠른 평형 가정), K1= [ES][I] / [ESI] [E0]= [E]+[ES]+[ESI] 이 때의 효소의 속도식을 전개하면, √ = Vm, app [S] (K’m2 / K’m, app + [S])

3-4-3. Uncompetitive Inhibitor √ = Vm, app [S] (K’m2 / K’m, app + [S]) By Lineweaver-Burk graph method, 반경잭적 저해반응의 실제효과를 살펴보면 분자 Vm와 분모 Km'의 감소이다. 위의 식 에서, 분자에 있는 Vm의 감소가 Km'의 감소보다 그 영향이 더욱 두드러지기 때문에 결과적으로 효소반응속도의 감소를 가져온다.

3-4. Inhibited enzyme kinetics By Lineweaver-Burk graph method (Michaelis-Menten equation 과 비교),

Effects of pH, Temperature, and Concentration 4

4-1. Effect of Temperature 화학반응의 속도는 반응온도에 의해 영향을 받으며 대개 온도가 10℃ 상승하면 반응속도가 약 2배 증가 반응속도식에서 온도의 영향을 받는 인자는 반응속도 상수. (즉, 반응속도에 영향을 미치는 온도의 영향은 반응속도 상수(k)의 온도의존성으로 나타낼 수 있다)

4-1. Arrhenius Equation 반응속도 상수의 온도의존성 k(T)는 일반적으로 아레니우스(Arrhenius) 식으로 표현(A historically useful generalization supported by the Arrhenius equation is that, for many common chemical reactions at room temperature, the reaction rate doubles for every 10 degree Celsius increase in temperature) The Arrhenius equation is a simple, but remarkably accurate, formula for the temperature dependence of the reaction rate constant, and therefore, rate of a chemical reaction. The equation was first proposed by the Dutch chemist J. H. van 't Hoff in 1884; five years later in 1889, the Swedish chemist Svante Arrhenius provided a physical justification and interpretation for it. It is found experimentally for many reactions that a plot of k(T) against 1/T gives a straight line.

4-1. Arrhenius Equation 온도에 의존하는 반응속도식 (The temperature dependence of reaction rates) k: 반응속도 상수 A: 빈도 인자(frequency factor), k와 같은 단위를 갖는다. Ea:활성화 에너지(activation energy, J/mol) R: 기체상수(universal gas constant, 8.314 J/mol K) T: 절대온도(K)

Arrhenius 법칙에 따른 반응의 온도의존성 4-1. Arrhenius Equation 여러 온도에서의 반응속도 실험 데이터로부터 활성화에너지 구하기 - 아레니우스(Arrhenius) 식은 비교적 넓은 온도범위에서 반응속도 상수의 온도의존성을 잘 나타내며 온도가 증가할수록 반응속도 상수가 증가함을 나타낸다. 아레니우스 식에 들어 있는 활성화 에너지 Ea는 반응이 일어나기 위해서 반응물의 분자가 가져야 하는 최소에너지로서, 여러 온도에서의 반응 속도 실험데이터로부터 양변에 대수(loge)를 취한 식을 이용하여 Ea 값을 구함 Arrhenius 법칙에 따른 반응의 온도의존성

4-1. Arrhenius Equation 반응속도의 온도의존성은 활성화 에너지(Ea)의 크기에 따라 결정되는데 Ea값이 큰 반응은 기울기가 크므로 온도변화에 민감하고, Ea가 낮은 반응은 온도변화에 대해 덜 민감하다. 이러한 특성을 활용한다면 온도에 따라 원하는 반응을 선택적으로 진행시킬 수 있도록 반응조건을 선택할 수 있다

4-1. Effect of Temperature - 효소 반응- 효소에 의한 촉매반응의 속도는 일정 한계까지 온도에 따라 증가 (이 온도 영역은 활성화에너지 증가하는 영역이며 온도활성화 영역이라 함 반응 속도는 아레니우스 식을 따른다) 효소반응은 다른 화학반응보다 온도 범위가 좁으며, 특정 온도 이상이 되면 단백질인 효소는 변성되어 온도가 증가하면 효소의 활성도는 오히려 감소 (이 온도 영역을 온도 비활성화 (deactivation) 또는 열변성(thermal denaturation) 영역이라 함)

4-1. Effect of Temperature - 효소 반응- 온도에 의한 변성속도는 다음과 같다. [E]: 효소농도 Kd: 비활성 상수 이 때, Kd 역시 Arrhenius 식의 형태로 온도에 따라 변한다. Ed: 비활성화 에너지(kcal/mol)

4-1. Effect of Temperature - 효소 반응- 결과적으로 효소 촉매반응의 온도에 따른 변화식 대체로 온도가 10℃씩 오를 때마다 효소반응의 속도는 약 두 배로 증가한다. 이것은 기질과 효소의 분자운동이 증가하여 서로 접촉할 수 있는 기회가 늘어나기 때문이다. 그러나 효소는 단백질이므로 열이 너무 많이 가해지면 형태가 변해서 제 기능을 못하게 된다. 대부분의 경우 50～60℃ 이상의 온도에서는 효소의 활성도가 급격히 감소한다(figure). (예외. 아주 높은 온도에서 잘 작용하는 효소도 있다. 예를 들어, 온천지대에서 발견되는 미생물에는 내열성 효소가 존재)

4-2. Effect of pH 효소에 의한 반응이 다른 화학반응과 크게 다른 점 중에 하나는 효소반응 속도가 pH에 크게 의존된다는 것. Why do these phenomena take place? - 효소는 단백질인데 단백질은 아미노산으로 구성. 아미노산은 아미노기와 카르복실기를 갖고 있어 수용액 중에서 이온의 상태로 존재한다. 어떤 효소들은 활성부위에 이온(ion)을 갖고 있고, 이들 이온은 효소의 촉매기능을 위하여 적합한 형태(산성 또는 염기성)로 존재하여야 한다. 즉, 반응액의 pH가 변하면 활성부위의 이온형태가 변화되고, 효소의 활성도가 바뀌게 되고 결국 반응속도도 변한다. 최적 pH 란? - pH가 변함에 따라 효소의 3차원 구조도 조금씩 변하며 특정 pH에서 기질과 가장 잘 결합할 수 있는 모양이 되는데, 이처럼 효소를 가장 활성화시키는 pH

4-2. Effect of pH 최적 pH - 최적 pH는 효소에 따라 다르다. - 위(stomach)에서 작용하는 펩신(pepsin)은 최적 pH가 2 정도로 매우 강한 산성이다. 장에서 작용하는 트립신(trypsin)의 최적 pH는 8정도이며, 녹말을 분해하는 아밀라아제(amylase)의 최적 pH는 7정도이다. 실제로 인체는 위의 pH를 1-2로, 장의 pH를 8 내외로 조절하여 효소의 활성을 극대화한다. Effects of pH for pepsin and trypsin

4-2. Effect of pH 이온화 효소에 대한 효소 반응속도

4-2. Effect of pH 라고 하면, 효소의 최적 pH는 pK1과 pK2 사이에 존재한다.

4-3. Effect of Substrate Concentration 기질의 농도가 지나치게 높은 경우 오히려 효소반응을 저해한다. 이 경우를 기질 저해반응(substrate inhibition)이라 한다. 이것은 일종의 반경쟁적(uncompetitive)저해로서 기질이 ES 복합체와 반응한다 Rapid equilibrium approach (빠른 평형 가정), [E0]= [E]+[ES]+[ES2]

4-3. Effect of Substrate Concentration 기질농도가 효소 반응속도에 미치는 영향 (Michaelis-Menten equation): 기질 농도 증가에 따라 반응 속도 증가하다가 일정 상수 (최대치)에 접근 기질 농고가 지나치게 높을 경우 효소 반응 저해 By Lineweaver-Burk plot method,