10. Starter 미생물(2) 1. 유산균 starter 활력 감퇴 증상 – 산생성력 감소 - 풍미생성 감소 - 고산도 - gas 발생, 이상취 1) 산생성량 감퇴 - 원인 : 균주변이, 잡균오염, 이상유, 방부제, 살균제, 항생물질, phage 오염 a) 잡균오염 - 대장균, 포자형성균 - 스타터 산응고 지연 -> gas 발효, peptone 화 초래 - 원인 : 살균부족 -> 완전한 살균 관리부족 -> 관리철저 b) 이상유 중의 lactenin ☞ 정균작용 : 원유 -> 방치 -> 처음 세균수 감소 -> 다시 증가 => 세균 생육저해물질 lactenin 1,2,3 가 관여 * lactenin 1 – 초유중 많이 존재 - Lactococcus cremoris, Staphylococcus pyogenes 를 특이하게 저해 - 지방응집소(agglutinin)과 동일물질 -> 우유지방 응집 -> 세균과 함께 부상 => 탈지유부분 세균수 감소 이유

10. Starter 미생물(2) * lactenin 2 – 상유 중 많이 존재 - Lactoperoxidase 와 동일 물질 -> quinone 구조 산화 생성물 형성 -> 유산균 생육 저해 * lactenin 3 - 초유, 상유 중 존재 * lactenin 들은 - 유방염유나 lipase를 많이 함유한 이상유 중에 많이 존재 -> lipase 함유 : 미생물 오염의 간접적 증거 - 스타터 활력 저해 - 60 ~ 75℃, 30분 살균에서 파괴 -> 정상적 열처리에서는 문제되지 않음 c) 항생물질 - 페니실린 : 세포내 단백질, 세포벽 합성 저해 -> 유산균에 가장 심각 -> 억제 정도 0.05 unit /ml -> 약간 0.1 ~ 0.15 unit/ml -> 산 생성지연 0.25 ~ 0.5 unit/ml -> 완전 억제 -> 열에 안정 : 100℃, 30분 가열 -> 50% 활력 유지 - streptomycin : 호기성 균 저해 -> 세균의 ribosome 공격 -> 단백질 합성 저해

10. Starter 미생물(2) d) 살균제, 세제 - chlorine 화합물 : 25 mg/ml -> 스타터 생육 억제 - 4급 암모늄 화합물 : -> 양이온 계면 활성제 -> 세포막 인지질의 음전하에 결합 -> 세포막 투과성에 변화 -> 0.1 ~ 1.0 mg/ml -> 스타터생육 억제 - 염소제 -> 특정효소의 SH group 산화 -> 생육억제 -> 25 ppm 이상에서 산 생성 저해 e) 지방산 - 유지방 유리 지방산 -> 유산균 생육 저해 lipase - Capric acid (C10:0), Caprylic acid (C8:0), Lauric acid (C12:0) 의 영향이 큼 - 배지의 표면장력 저하로 세균생육억제 - Lac. cremoris : oleic acid 50 ~ 100 ppm 에서 현저하게 발육 억제 f) 항균물질 - 유산균이 생산하는 bacteriocin, 우유 중의 혼입 항생제 등이 원인 g) Bactriophage - 유산균 용균 사멸 - 배양초기에 유산균 사멸 -> 산생성 저해 - 균 종류에 따라 여러가지 phage 가 존재 - 산도높으면 세포 흡착 저해 -> 산생성 왕성균 파지 감염 적음

10. Starter 미생물(2) h) plasmid 손실 * plasmid – 세균내 염색체 이외의 DNA 구조 - 계대 배양 중 손실 가능성 있음 - 유산균의 유산 생성 조절인자 보유 -> plasmid 손실 시 산 생성력 감소 2) 풍미 생성 부족 - diacetyl : 배지 pH 산성일 때 생성 -> 산생성부족 -> high pH -> 풍미 생성 부족 초래 -> 버터 culture 의 Streptococccus 첨가량 부족, 활성 약하면 -> 풍미 생성 부족 - 4 급 암모늄 화합물 -> 풍미생성 현저하게 억제 - 구연산 함량 낮은 원료유 - diacetyl 파괴 gram- 균 오염 - 과도한 산 생성 - 풍미 생성균 phage 오염 : Lac. diacetylactis 용균 phage 3) 고산도 - 내산성 약한 균 활력 저하 - 원인 : 배양온도 상승, 배양시간 연장, 접종균 과잉 4) 유청 분리 (whey off) - 우유 산 응고 후 탈지유 표면에 whey가 분리되는 현상 - 원인 : 낮은 고형분 함량, 적은 스타터 접종량 -> 유산균 생육 부족 -> 낮은 산도 알코올 양성유, 잡균 오염

10. Starter 미생물(2) 5) gas 발효 - curd 부상 원료액의 Fe 제거 -> 대장균, 낙산균의 gas 발생 억제 효과(실험 결과) - 스타터 중 Leuconostoc : 약간의 gas 생성 -> gas 생성력이 높은 균주는 스타터로 부적절 6) 점질화 - 다양한 미생물이 점질화 유발(glycocalyx, slime layer) - Alcaligenes viscosus, Micrococcus 오염 -> 점질화 -> 이상취 생성 - 유산균의 점질화 -> 오히려 유익 : 유청분리 방지, 농후 발효유 제조 7) 이상 풍미 생성 - 유산균 단백분해균 -> 쓴 맛 생성 - 맥아취(Lac. lactis var. maltigenes), green flavor(유산균), 효모취, 우사취, 사료취 - 잡균오염, 이물질 오염이 주 원인

10. Starter 미생물(2) 2. Starter 균주 개량 - 스타터미생물 활력 감퇴 -> 활력회복, 활력 강화 필요 -> 균주보존의 정확한 방법 확립이 더 중요 1) 자연돌연변이에 의한 방법 - 발현율 1/108 - 내산성균주, 파지 저항성균주 자연 발생 2) 인공돌연변이법 - DNA 염기배열 손상물질 처리 : mitomycin C, NTG(nitrosoguanidine), NO2-, NH2OH, 자외선 등 - 처리후 특정균주 선별 : selection marker 이용, selection properties - 실효성은 낮음 3) 유전자 교환법 - 서로 다른 세포의 필요유전자를 교환 혹은 축합 -> cell fusion 1. 균주 선발 -> 보완 성질을 가진 균주 2. genetic marker 개발 -> 선발균주의 특이적 유전인자 이용 3. 세포벽 용해 -> lysozyme, acetylmuramidase 등 세포벽 특성에 맞는 효소이용 4. protoplast 형성 -> 세포벽 제거된 원형의 원형질체 5. cell fusion -> 적당한 삼투압 유지, PEG(융합촉진제)처리 -> 유전물질교환 6. regeneration -> cell fusion 후 세포벽 재생 -> 정상세포로 복귀 7. 유용균주 선별 -> 목적 형질을 가진 새로운 균주 선발 8. 새로운 균주의 유전적 안정성 검사 -> plasmid stability, replication, 9. 새로운 균주 탄생

10. Starter 미생물(2) 2. Starter 균주 개량 4) 유전자 도입법 - 특정의 유전자만을 스타터균주 내에 주입 - 유산균의 유전자 지도확인 필요 - 유산균 세포벽 용해기술 개발 필요 - 제한효소 개발 - vector 개발

10. Starter 미생물(2) 3. Starter 와 Bacteriophage -> 살아있는 세포에서만 증식 -> 세균 특유의 phage를 가짐 1) 특징 - small size : 세균의 수십분의 1 (세균크기 : 1μm) - 독자적 증식 불가 -> 세포안에 침입 증식 - 빠른 증식 속도 - host range 가 좁다 2) 형태 - head, sheath, tail 로 구성 - 유전물질 -> DNA, RNA HIV Adenovirus Bacteriophage

10. Starter 미생물(2) 대장균 phage

10. Starter 미생물(2) 3) 증식 - 조건 : 숙주세포의 생육조건과 같다 (온도, pH, 수분) - 흡착 -> DNA 주입 -> 증식 -> 형성 -> lysis - 빠른 증식 속도 : 대장균 -> 20분 - latent period : 숙주 흡착 후 잠복기 - burst size : 1개의 phage에서 방출된 phage 수 60 ~ 90/유산균

10. Starter 미생물(2) 4) 종류 - virulent phage(용균성) : 흡착 후 반드시 lysis -> 증식력 강함 -> 발효유가공공장의 문제 야기 - Temperate phage (용원성) : 숙주세포의 염색체 속에 잠복 (prophage) -> 자극 받으면 활성화 (자외선, mytomycin C)

10. Starter 미생물(2) 5) 발효제품공장의 phage 오염 - 스타터 오염 -> 산생성 없음 -> 잡균 증식 -> 폐기 - 원인 : 동일균주 장기간 사용 -> 종균 확산 -> phage 오염 및 확산 -> culture 오염 - 대책 : - 예방이 최우선 (종균 사전 검사, 살균) - phage 저항균주 개발 - 혼합균주 사용 - 우유 중 Ca+2 불활성화 (인산염, 구연산 사용) -> phage 증식 과정 중 Ca 필요 - phage 수 측정 : plaque count -> 살아있는 세포와 죽은 세포를 구별하는 염색약 사용 Virus plaque phage plaque