KNU Microbial Biotechnology Laboratory 경북대학교 미생물공학연구실 KNUmbl 14장. 용매발효 응용생명과학부 생명식품공학전공 박 희 동 2018-12-05 KNU Microbial Biotechnology Laboratory

KNU Microbial Biotechnology Laboratory 14-0. 용매와 주정 * 용매: 주정, glycerol, acetone·butanol 등의 생산을 목적 └ 합성법에 의해 대부분이 생산 * 주정과 에탄올 1) 주정(wine spirit): 에탄올을 85%(v/v) 이상 함유하는 방향의 무색 액체 (15℃의 비중: 0.7947) %(v/v) = 1 도 = 2proof * 우리나라 주세법상 95% 이상 - 음료, 도료, 염료 등의 원료, 기타 화학공업 2) 에탄올: 순수한 화학성분을 칭함 - 실제 순수하게 제조 못하나 성분을 위주로 얘기할 때 - 시약 등 * 주정의 종류 1. 발효주정: 발효에 의해 생산된 주정 -음용 및 일부는 공업용으로 사용 2. 변성주정(공업용주정): 주정에 메탄올과 색소를 첨가 -음용으로 사용 못하게 제조: 용매, 연료 3. 합성주정: 화학 합성에 의해 제조된 주정 -공업용으로만 사용 C2H4(ethylene, CH2=CH2) + H2O ----------→ C2H5OH(ethyl alcohol) 2018-12-05 KNU Microbial Biotechnology Laboratory

KNU Microbial Biotechnology Laboratory 14-1. 알코올발효의 원리 1) 이론적 에탄올 생성비 : 대전분: 92.14/162.14, 대당: 92.14/180.16 - 원료의 무게로부터 생성되는 에탄올의 무게 추정 가능 - 무게 또는 부피(15℃일때 비중 0.7947) 가) 증류법에 의한 알코올 농도 측정 : 100ml 증류하여 약 80ml 회수 후 증류수로 100ml 정용 - 15℃ 냉각 후 주정계로 눈금 (부평법) - 주정도 온도 보정표로 보정할 수 있음 나) 에탄올 생성량과 CO2 생성량의 관계 에탄올 생성량 g = CO2 생성량 × 92.14/88.02 : CO2 감량법-발효중 무게 감소 측정 (기체 산물 : CO2 + H2O - 황산으로 H2O 포집 -CO2 감소량) 2018-12-05 KNU Microbial Biotechnology Laboratory

KNU Microbial Biotechnology Laboratory 2) 발효율 (fermentation ratio, %) : 이론적 에탄올 생성량에 대한 실제 알코올 생성량 % - 약 87~95% - 효모의 생육에 약 2-4%의 당이 소비 가) 이론적 알코올 생성량 : 당 함량으로부터 알코올 fid(l)으로 환산 : 담금 술덧의 총당 % (w/v) ÷ 100 × 용량 (l) × 92.14/180.16 ÷ 0.7947 (당의 양 kg) (대당 알코올 생성비) (비중) * 비중으로 나누기 전의 값 : 알코올 량(kg) 나) 실제 알코올 생성량 : 숙성 술덧의 알코올 함량과 술덧의 양으로부터 환산 : 숙성 술덧의 알코올 함량 % (v/v) ÷ 100 × 용량 (l) (술덧을 증류하여 얻은 분석치) * 술덧: 담금 후부터 발효 종료까지 혼합물 – 담금 술덧, 숙성 술덧 (원료에 효모 혼합하여 발효 유도) - 담금 술덧과 숙성 술덧 용량의 차이 : 발효에 의해 원료가 분해 2018-12-05 KNU Microbial Biotechnology Laboratory

KNU Microbial Biotechnology Laboratory 14-2. 당질원료에서의 주정발효 * 주정발효의 원료 1) 당질원료 음용-당밀(주 사탕수수), 사탕수수 즙 또는 농축즙, 대추야자 열매 공업용 - 폐당밀 (설탕 분리 후 남은 찌꺼기), 아황산 펄프 폐액(주로 침엽수) 2) 전분질원료: 음용 -효소에 의한 당화 공정 곡류: 옥수수, 보리, 쌀, 조, 피, 서류: 고구마(생-, 절간-), 타피오카(카사아버 가공품), 감자, 돼지감자 3) 섬유질원료: 목재 및 농업 폐기물 산당화(H2SO4, HCl)하여 이용 -공업용 -겨, 볏집, 고구마 덩굴 1. 회분식 발효: 제한된 기질로 1회 발효 원료당밀 희석 발효조성제 첨가 살균 발효 증류 및 정제 유안, 쌀겨 주모제조 가. 주모(술밑, seed mash, motto) : 효모를 확대 배양한 것 -잡균오염 억제하며 안전하게 효모를 배양하는 것이 중요 -당밀을 총당 10%로 희석 – 유안 첨가 (0.5-1g/l) - 황산으로 pH4.5 조절 -살균 후 효모(S. cerevisiae, 이전 S. formosensis) 접종 -30℃ 2일 배양 - 초기 16-20 시간 통기 (통기량 0.01V/min) 2018-12-05 KNU Microbial Biotechnology Laboratory

KNU Microbial Biotechnology Laboratory 나. 발효 : 주모 발효조 이동 + 총당 16%의 당밀 희석액 (pH 4.5) -30-35℃에서 2일 발효 – 약 8%의 알코올 함유 * 최근 고농도 술덧 발효법 연구 : 시설비 및 운전경비 감소, 관리 용이 2. Melle-Boinot 법 : Reuse 연속법 –증류 전 술덧으로부터 효모 회수하여 다음 발효 사용 -회수 효모: pH2.5조절 후 2시간 방치 - 잡균 도태 - 3개월 마다 효모 바꿈 3. 연속발효법 1) 다단식 연속 발효법: 브라질, 아르헨티나, 유럽 각국 - 4-8개의 발효조를 직렬 연결 - 1-2단: 저 에탄올, 저당농도에서 통기하여 효모 생육 촉진 - 균체 재이용 - 뒤의 조에 고농도의 당액 공급하여 고농도 에탄올 발효 가능 2) 고정화 효모에 의한 연속 발효 : 고정화 효모를 발효조에 충진하고 하부로부터 당액 공급 - 당액이 상승하면서 발효 진행 (하부: 저알코올, 고당, 상부: 고알코올, 저당) - 상부로부터 발효액 회수 및 증류 4. two stage법(Hildebrandt-Erb법) - 증류 폐액(상당량의 비발효성당 함유)을 가수분해하여 효모증식에 이용 * 주정 증류 폐액의 처리 예 : 폐액 – 원심분리 – 침전물은 건조하여 사료 이용 : 여액은 농축 후 건조하여 침전물 건조 사료에 첨가 2018-12-05 KNU Microbial Biotechnology Laboratory

KNU Microbial Biotechnology Laboratory 14-3. 전분질원료로부터 주정발효 * 당화제 : 전분질 원료의 경우 반드시 당화 -amylases 혼합 1) 국 (코지, koji): 증자곡류에 순수한 형태의 국균 곰팡이를 번식시킨 것 - 일본 2) 누룩 (곡자, Kokja, Nuruk): 밀기울에 곰팡이를 번식시킨 것 - 한국 - 자연 곰팡이, 효모 다량 함유 - 주로 Aspergillus 속과 Rhizopus 속 3) 맥아(엿기름, malt): 보리를 발아시킨 것 - 각종의 효소 함유(amylase, protease, glucanase) 4) 산당화: 산의 존재하에 가열 - 섬유질 원료 경우 주, 전분 경우 거의 사용 무 - 염산, 황산 5) 효소제: 액화효소 및 당화효소 - B. subtilis의 α-amylase와 Rhizopus sp.의 glucoamylase * 발효방법 : 당화(곰팡이 당화형 amylase 사용) 방법에 따라 7 가지로 분류 국법(koji법), amylo법, amylo주모 코오지절충법, 코오지주모 효소법, 효소법, (맥아법, 산당화법) 2018-12-05 KNU Microbial Biotechnology Laboratory

KNU Microbial Biotechnology Laboratory 1. 원료의 증자 : 호화 목적 -효소의 작용 용이 1) 회분식 증자법 : 회분식 가압증자 - 증자솥 이용 : 2-4Kg/cm2 * 30 - 100분 2) 연속식 증자법 : 미세하게 분쇄한 원료와 물을 혼합하여 slurry 제조 - 증자관을 통과시키면서 증자 150-160℃ * 3-6분 처리 3) 연속 저온 증자법: 원료, 내열성 액화형 amylase (B. subtilis) 혼합 - 85℃ * 30 분 액화 후 증자기로 보내어 105℃에서 60분간 증자 2. 발효 : 전분의 경우 반드시 당화 공정 필요 가. 국법(코지법) : 주모제조, 발효를 위한 전분질 원료를 당화 국을 사용 - 증자 후 액화 및 당화 1) 고체국법(피국법, 밀기울 코지법): 고체상의 코오지를 효소제로 사용 : 밀기울과 왕겨 6:4로 혼합한 것에 국균 번식시켜 국 제조 * 국균으로 A. oryzae, A. shirousami 주로 사용 * 종국 : 국의 제조를 위해 첨가하는 국균 배양물 : 주모: 코오지 당화 후 젖산발효 또는 젖산 첨가하고 살균 후 효모배양 - 술덧의 5~10% 주모 사용 : 발효- 국 유래 잡균 때문 왕성하게 단시간에 발효 -보통 48시간에 종료 2) 액체국법(액국법): 액체상의 국을 효소제로 사용 액체배지에 국균(흑국균: A. awamori, A. niger, A. usami) 번식시켜 국 제조 - 밀폐된 배양조에서 배양하여 무균적 조작 가능, 피국법보다 능력이 감소 2018-12-05 KNU Microbial Biotechnology Laboratory

KNU Microbial Biotechnology Laboratory 나. Amylo법 : 원료에 직접 amylo균을 배양하여 당화시키는 방법 - 따로 주모를 제조하지 않고 원료 당화 후 바로 발효조에 효모 배양액 접종 당화 발효 전분 증자액 당 EtOH : 한 개의 발효조에서 2단계 진행 amylo균 효모배양액 장점: 간단하고 편리, 한 개의 발효조 사용, 잡균오염의 위험 감소 단점: 발효속도 지연, 관리 곤란, 발효액의 알코올 농도가 낮음 1) 원료 : 충분한 질소 함량이 중요 - amylo균의 증식, 당화력에 영향 - 유안, 쌀겨등과 혼합하여 질소원 보충 2) Amylo균 : Mucor rouxii(= formerly Amylomyces rouxii)를 사용하여 개발 - 현재 R. delemar(곡류), R. javanicus (서류) 포자를 접종하여 배양 - 포자 생산: 멸균한 5~8mm 두께 감자 절편 표면에 amylo균 접종하여 배양 - 최적 37-38℃ 유지 3) 효모 : S. cerevisiae (이전에는 S. anamensis 사용), S. cerevisiae 발연1호 - amylo균의 생육 적온에서도 잘 발효(35~38℃) 2018-12-05 KNU Microbial Biotechnology Laboratory

KNU Microbial Biotechnology Laboratory 다. amylo 주모 국 절충법 주모의 제조를 위해서는 amylo법, 발효를 위해서는 국법으로 전분질 원료 당화 고체국: amylo 주모 고체국 절충법 -- Asp. oryzae, Asp. shirousami 액체국: amylo 주모 액체국 절충법 -- Asp. awamori - 주모 배양 시 잡균오염 감소, 발효속도 양호, 알코올 농도 증가 라. 국 주모 효소법 ; 주모 제조에 코오지 이용 및 담금에는 효소이용 원료처리 : 액화효소 처리 및 증자 - 연속저온증자 주모 : 증자원료에 코지(주로 액체 코지)와 효모 첨가하여 배양 주요 : 증자원료에 당화효소 첨가하여 당화 (60℃ * 1-2 시간) - 당화 후 주모를 첨가하여 발효 유도 * 액화효소 : B. subtilis의 a-amylase, 당화효소 : Rhizopus sp.의 glucoamylase 마. 효소법 : 주모제조와 담금에 모두 당화효소 사용 -고구마를 원료로 할 경우 산업화 되어 있음 2018-12-05 KNU Microbial Biotechnology Laboratory

KNU Microbial Biotechnology Laboratory 14-4. 증류 1. 증류이론 : 증류(비등과 응축) * 증류: 주정분을 물과 분리하여 농축 : 술덧 중 6~9% - 주정에 95% 이상 함유 - 에탄올, 물 혼합액 가열 시 에탄올 먼저 휘발하여 증기의 에탄올 농도 증가 (100% 에탄올 비점: 78.3℃, 물 비점: 100℃) - 응축하여 증류액 제조 : 에탄올 농도 증가, 비점 감소 - 일정 농도가 되면 에탄올 농도와 비등점이 일정한 값에 도달 * 공비점: 증류를 계속하여도 주정농도와 비점의 변화가 없을 때의 비점 - 증류 시 용액과 증기의 조성이 일치할 때의 비점-물과 에탄올 동시 비등 비점: 78℃(100% 에탄올 78.3℃), 응축점: 15℃, 주정분: 97.2 % (v/v) = 95.57 % (w/w) - 이 때의 혼합물을 공비혼합물 - 증류로 더 이상 알코올의 농도 증가 불가능 가. 알코올 증발계수(Ka) : 증기 중의 알코올 농도 % / 용액 중의 알코올 농도 % - 용액 중의 알코올 농도가 높아지면 알코올 증발계수는 감소 - 공비점에서는 일정 : Ka = 1.0 나. 정류계수 : Kn/Ka (불순물의 증발계수(Kn)와 알코올 증발계수(Ka)의 비) 정류계수<1.0 - Kn<Ka : 증기 중 불순물 농도가 용액 중 농도보다 감소: 정제 = = : 와 동일 > > : 보다 증가 2018-12-05 KNU Microbial Biotechnology Laboratory

KNU Microbial Biotechnology Laboratory * 비등응축 곡선 : 증류 시 비점에 대한 용액과 증기의 알코올 농도 변화 곡선 - 증류를 계속하게 되면 그 때의 비점과 알코올의 농도가 이 곡선과 일치 혼합액 알코올 %(v/v) 10 20 30 40 50 60 70 80 90 95 비등점 (℃) 100 92.50 87.50 85.00 83.75 82.50 81.25 80.00 79.38 78.75 - 증기중 51.00 66.20 69.20 71.95 74.95 78.17 81.85 86.49 91.80 95.35 증발 계수 Ka 5.10 3.31 2.31 1.80 1.50 1.30 1.17 1.08 1.02 1.004 2018-12-05 KNU Microbial Biotechnology Laboratory

KNU Microbial Biotechnology Laboratory 2. 증류장치 가. 단식증류기(pot still) : 술덧을 가열하며 생성되는 증기를 냉각하여 채취 - 술덧 가열관, 응축기, 예열기(옵션) - 고형분, 수용성 비휘발성 성분 제거 - 휘발성 불순물 제거 곤란 : aldehyde, ester, fusel oil, 휘발산-독특한 향미(증류주) * 퓨젤유 주성분: 고급알코올, 미량성분(고급지방산에스테르, 푸르푸랄, 아민, 지방산) 나. 연속식 증류기(patent still) : 탑의 상단으로부터 술덧 일정량 공급 - overflow pipe를 통해 하단으로 이동, 하단으로부터 증기 취입 - 증기가 통기관을 통해 위로 상승하며 시렁의 술덧을 가열하여 증기 발생 - 상단 : 고 알코올, 하단 : 저 알코올 - 탑 정상의 증기는 냉각기로 응축하여 알코올로 유출 CH3-CH-CH2OH CH3 iso-butyl alcohol : Val 유래 : 10% CH3-CH2-CH-CH2OH Active amylalcohol 2-methyl-1-butanol : Ile에서 유래 : 5% CH3-CH-CH2-CH2OH iso-amyl alcohol: Leu 유래 = iso-pentyl alcohol = (3-methyl-1-butanol) : 45% 2018-12-05 KNU Microbial Biotechnology Laboratory

KNU Microbial Biotechnology Laboratory -단식증류기(위스키용) 2018-12-05 KNU Microbial Biotechnology Laboratory

KNU Microbial Biotechnology Laboratory -단식증류기(브랜디용) 2018-12-05 KNU Microbial Biotechnology Laboratory

KNU Microbial Biotechnology Laboratory -연속식 증류기 : 연속증류탑 2018-12-05 KNU Microbial Biotechnology Laboratory

KNU Microbial Biotechnology Laboratory * 연속증류탑의 구조 및 기능 1) 술덧탑 : 3-11개의 술덧탑으로 구성 : 각각에 응축기 부착 - 탑 내부 여러 개 시렁 (보통 17단) : 아래로부터 증기 취입(하부고온) - 술덧을 탑 상부로 공급하여 가열, 동시에 증기를 회수하여 응축기로 보냄 - 증류 폐액 : 바닥으로 배출 - 고형분이나 비휘발성 성분 2) 응축기(열교환식 냉각기) 및 가스분리기 -- 3개의 응축기로 단계적 응축 : 응축기 - 냉각수 양 조절하여 알코올 응축, 저비점 성분은 응축 불가 acetaldehyde(bp= 21ºC), 메탄올(64.7ºC) : 가스분리기 : 일부를 개방하여 CO2, 저비점 성분 기체상태로 공기 중 휘발 3) 퓨젤유(fusel oil) 분리기 (농축탑) : 알코올의 0.3-0.6%가 퓨젤유 : 퓨젤유의 정류계수 (Kn/Ka) = 알코올 농도 42~43%에서 1.0 - 증류 시 퓨젤유는 알코올 42~43% 농도의 것에 존재 - 이 농도의 알코올 회수하여 20% 이하 희석 -퓨젤유가 기름처럼 부상 –제거 4) 추출탑: 가수증류(추출증류) : 불순물 많은 부분 회수 희석(10%)하여 재증류하여 불순물 제거 5) 정류탑 : 알코올을 농축하여 회수 - 농축부와 회수부로 구성 - 상단(저온) : 고알코올, 하단(고온) : 저알코올 (정류탑으로 환류) 6) 정제탑: 96%의 알코올에 함유된 소량의 메틸알코올과 저비등점 성분의 제거 7) 불순물 처리탑 : 탑 정상부 저비점 불순물 함유 부분을 농축하여 불순물 제거 - 불순물 제거하고 남은 액을 술덧탑으로 순환 2018-12-05 KNU Microbial Biotechnology Laboratory