Western blot
Materials 1. Electrophoresis 2. Transfer 3. Blocking - SDS-PAGE gel (10%) - electrophoresis buffer 2. Transfer - Transfer buffer - PVDF 3. Blocking - Blocking buffer (skim milk + PBS or TBS + TWEEN20) 4. Binding of 1st Antibody - Primary antibody in BSA + PBS or TBS + TWEEN20 + sodium azide(1:1000 dilution) 5. Binding of 2nd Antibody - Secondary antibody in skim milk + PBS or TBS + TWEEN20 (1:10000 dilution) 6. Washing - TBST or PBST (PBS or TBS + TWEEN20)
Methods 1. SDS-polyacrylamide gel 만들기 2. Sample 준비 3. Gel electrophoresis -Gel caster에서 gel을 떼어낸 다음 tank에 장착하고 tank buffer를 채운다. -Sample 을 loading한 후 dye가 바닥에 올 때까지 running한다. 4. Transfer -membrane, 3M paper(4장 준비)를 sponge 크기에 맞게 미리 자른 후 transfer buffer에 담가둔다. -Transfer sandwich 만들기 (black) sponge/paper/gel/membrane/paper/sponge (white) -transfer tank 에 장착하고 transfer한다. (100V, 300 mA, 2h) Gel/Membrane Sandwich
Methods 5. Washing 6. Blocking (1h / RT) 7. Washing Rocker위에서 PBST or TBST 로 10분간 3번 씻어준다. 6. Blocking (1h / RT) 5% skim milk in PBST or TBST에 membrane을 담가두고 rocker에 둔다. 7. Washing blocking solution을 버리고 Rocker위에서 PBST or TBST 로 10분간 3번 씻어준다. 8. 1st Ab binding (overnight/4도) washing solution을 버리고 5% BSA in PBST or TBST에 GFP-Ab (1:1000)를 부운 후에 rocker에 밤새 둔다. 9. Washing primary Ab를 버리고 Rocker위에서 PBST or TBST 로 5분간 4번 씻어준다. 10. 2nd Ab binding (1h/RT) washing solution을 버리고 5% skim milk in PBST or TBST에 anti-rabbit IgG-Hrp Ab (1:10000) 를 부은 후에 rocker에 1시간 둔다. 11. Washing secondary Ab를 버리고 Rocker위에서 PBST or TBST 로 10분간 3번 씻어준다. 12. detection 암실에서 OHP필름 사이에 membrane을 넣고 ECL을 뿌려준 후 필름을 올려 감광시키고 현상한다.