Anti-CCP Ab 검사 진단검사의학과 면역혈청파트 김 영 란

CCP 항체 검사 Microplate를 이용한 수기법 자동화 장비로의 전환 검토 CCP 항체검사 시약 6가지의 비교

Rheumatoid arthritis (RA) 자가면역질환의 일종 연골이 면역반응의 표적임 “작은 관절”인 손, 손목, 발, 팔꿈치를 주로 침범 뼈와 연골의 침식(erosion), 활막염(synovitis), 관절막의 팽창 등으로 증상이 유발됨

Rheumatoid arthritis

RA의 진단기준 American College of Rheumatology Criteria (1987) Morning stiffness (수면 후 강직으로 1시간 이상 강직) Arthritis of three or more joint (관절 세 개 이상 침범) Arthritis of hand joints (수부 관절들의 종창) Symmetric arthritis (대칭성 종창) Rheumatoid nodules (작은 결절) Serum rheumatoid factor IgM Radiographic changes (방사선학적 변화) 위의 7가지 중에서 4개 이상 만족할 경우 RA로 진단 (단, 1~4번은 6주 이상 지속 될 때)

RA에서의 혈액검사 CBC with PLT ESR CRP Rheumatoid factor IgM Rheumatoid factor isotype (IgG, IgA) Anti-cyclic citrullinated peptide (CCP) Ab

Rheumatoid factor 낮은 민감도 낮은 특이도 RA 환자의 65-75%에서 검출 무증상 건강인의 5-10%에서 검출

RF가 양성으로 나올 수 있는 경우 류마티스성 질환 폐질환 감염 기타 류마티스관절염(~75%), 쉐그렌증후군(~90%), SLE (~20%) 폐질환 간질성섬유증(Interstitial fibrosis), Silicosis 감염 HBV, HCV, 결핵 기타 노화, 악성종양

RF를 대체할 검사의 개발 Anti-perinuclear factor (APF) 민감도 50%, 특이도 99% Anti-keratin antibody (AKA) 민감도 40-50%, 특이도 97-99% Anti-Sa 민감도 40%, 특이도 99% 공통적으로 특이도가 매우 높으나, 민감도가 낮으며, 구강점막의 세포를 사용하여 검사하는 관계로 다량의 세포 확보가 어려움

Anti-cyclic citrullinated peptide Ab 특이도가 우수한 APF, AKA의 target Ag이 citrullinated filaggrin임 특이도는 유지하면서, 민감도를 증가시키기 위하여 citrullinated filaggrin의 일부 peptide만을 target Ag으로 제조함 민감도를 극대화시키기 위하여, Ag의 3차원구조를 linear에서 circular form으로 변형 Serine(S)을 Cysteine(C)로 치환하여 circular form 유발

Anti-CCP의 현재 “초기” RA의 진단용 표지자 높은 특이도 RF와 비슷한 민감도 (약 80%까지 보고) 발병예상 가능 초기 진단으로 인한 초기치료를 통하여 관절손상 예방 높은 특이도 RF와 비슷한 민감도 (약 80%까지 보고) 발병예상 가능 may be present up to 9 years before clinical onset of disease Titer와 질병의 활성도(Disease activity)와의 연관성은 아직 불충분 이유: 자연적으로 존재하는 Ag (Natural Ag)이 아닌, 인위적으로 제조한 peptide임

대상군 RA (59명): 류마티스성 관절염으로 확진 Non-RA (121명): 류마티스성 관절염 이외 퇴행성 관절염 (44명) 무증상 RF 양성인 자 (37명) 원인 미상의 관절염 (17명) 베체트병 (8명) 쉐그렌증후군 (9명) SLE (4명) Polyarthritis rheumatica (2명) 총 179명의 진단이 확실한 대상군을 포함한 검체

비교시약 Axis-Shield (U/ml) Microplate ELISA 기존 방법(현재) Bio-rad (U/ml) Euroimmune (RU/ml) Imtec (U/ml) Abbott Architect (U/ml) Automation 장비:有 Abbott Axsym (U/ml) 장비:無 Roche e411 (U/ml)

Microplate ELISA methods 제조사 방법 Incubation time (serum, conjugate, substrate), min No. of calibrator Conjugate Substrate Proposed cutoff Axis-Shield Diagnostics ELISA 60; 30; 30 5 AP anti-human IgG Phenophtalein monophosphate (PMP) 5 U/ml Euroimmune TMB 5 RU/ml Imtec 60; 30; 25 HRP anti-human IgG 25 U/ml Bio-Rad 6

Automated methods Architect i2000 Axsym E411 Assay format Chemiluminescent microparticle immunoassay Microparticle enzyme immunoassay Electrochemiluminescence immunoassay Labelled substance Acridinium Alkaline phosphatase Ruthenium Measuring range (U/ml) 0.5-200 1-200 7-1000 Proposed cutoff 5 17

Anti-CCP 검사방법 (ELISA) 검체희석(1:100) Calibrators (1-5), Reference Control, Negative, Positive control, 희석된 검체를 100μL씩 citrullinated peptide가 코팅된 microplate에 분주 60±5min incubation (RT) Wash 3 times AP-labelled murine mAb to IgG (conjugate) 100μL씩 분주 30±5min incubation (RT), Wash 3 times PMP sol.(Substrate) 100μL씩 분주 Sod. Hydroxide(Stop sol.) 100μL씩 분주 Reading (at 570nm/650nm)

기존 방법(Axis-Shield)과 자동화방법의 일치도 Architect i2000 Axsym e411 양성 음성 합 Axis- Shield 79 3 82 80 2 77 5 134 136 1 135 81 137 218 216 78 140 Percent agreement 97.71% 99.07% 97.25%

기존 방법(Axis-Shield)과 타 수기방법의 일치도 Bio-rad Euroimmune Imtec 양성 음성 합 Axis- Shield 78 4 82 52 1 100 101 36 37 35 79 104 183 53 89 88 Percent agreement 97.27% 98.88% 98.86% n 작음

Discrepant Results No. Axis-Shield (< 5 U/ml) Architect AxSYM E411 　진단명 Result Value 1 Pos 11.98 5.1 Neg 2.8 39.27 Sjogren SD 2 7.29 2.5 1.6 <7.0 Undifferentiated arthritis 3 16.34 11.3 15.5 13.61 4 9.02 2.6 6 Juvenile RA 5 14.50 10.8 11.7 14.73 RA 5.37 4.3 5.2 9.35 7 1.01 16.3 2.7 30.37 8 3.51 6.6 2.9

ROC curve analysis Area Under Curve Axis-Shield 0.945 Abbott Architect 0.951 Abbot Axysm 0.956 Roche E411 0.941

Anti-CCP 검사의 특징 일반적인 Screening 검사 Anti-CCP 검사 Sensitivity와 Specificity를 최대한 동시 증가 Anti-CCP 검사 Specificity를 우선하고, sensitivity를 증가 Specificity (%) Sensitivity (%) Axis-Shield (U/ml) 95.0% 84.5% Abbott Architect (U/ml) 82.8% Abbott Axysm (U/ml) 78.9% Roche e411 (U/ml) 89.7% Bio-rad (U/ml) 69.6% Euroimmune (RU/ml) 47.1% Imtec (U/ml) 52.9%