Western blot

실험 개요 Western blot Cell harvest Cell lysis 단백질 정량(Sampling) Gel electrophoresis (SDS PAGE) Transfer Blocking Primary, secondary antibody incubation Developing (using chemidoc)

Introduction 단백질의 구조 비공유결합에 의한 소수성결합, 수소결합, 정전기적 인력, 이황화(-S-S-)결합 등 α-나선구조 β-병풍구조 비공유결합에 의한 소수성결합, 수소결합, 정전기적 인력, 이황화(-S-S-)결합 등

Introduction Cell Lysis

Introduction Cell Lysis 50 mM Tris-HCl, pH 7.5 150 mM NaCl 0.1% SDS 1% NP-40 0.5% DOC (deoxycholate) (Option!) Protease inhibitor cocktail

Introduction Western blot

Introduction Western blot DTT / β-Mercaptoethanol

Introduction BCA method 단백질 용액에 Cu2+ 이온을 반응시킨 후, Bicinchoninic acid(BCA)가 Trp, Tyr, Cys의 도움으로 Cu+ 이온과 복합체를 형성하여 자색으로 발색하는 반응을 이용한 방법. - 562 nm 에서의 흡광도를 측정. - Standard curve로부터 농도를 결정. (Bovine serum albumin) - 다른 방법에 비하여 detergent (SDS, Triton) 등에 의한 영향이 적음. Bradford 용액

Introduction BCA method 1.083 0.689 Bradford 용액 OD값 BSA 250 500 1000 250 500 1000 2000 dosage 실험 결과 SDS-PAGE OD (y값) ug/ul (x값) X = (y-0.0732)/0.0583 로딩량 (uL) /30ug 30/x값 5X loding dye DW (or RIPA) 총볼륨 =20uL A 1.083 17.32075 1.7 4 14.3 20 B 0.689 10.56261 2.8 13.2 Bradford 용액 0 5 10 15 20

Materials & Methods Cell Lysis e-tube, scraper, PBS, centrifuge, RIPA, ice, DW, 96well plate, BSA, BCA [Dish에 직접 lysis buffer를 이용하여 단백질을 추출하는 방법] E-tube 2개를 준비하여 각각 A, B로 labelin한다. Dish에 있는 배지를 버린 후, DPBS 5ml을 넣고 washing 해준다. DPBS를 제거하고, 500μL의 RIPA buffer를 넣어주고, scraper를 이용하여 cell을 긁어서 떨어뜨리고, 이를 모아 각 e-tube에 넣는다. 15초간 vortex 하고, 30분간 ice에 incubation 해준다. (5-10분마다 15초씩 vortex 하여준다) 5. Cell을 모은 e-tube를 13000rpm으로 20분간 원심분리한다. 상층액을 따서 새로운 e-tube로 옮겨준다. (pellet까지 따지 않도록 조심하고, 이후 tube는 ice에 꽂아두도록 함)

Materials & Methods Sampling BSA BCA reagent (A : B = 1 : 50) 250 500 11. BSA (2000㎍/ml)을 DDW로 희석해 각각 (250, 500, 1000 ㎍/ml)을 만든다. 12. 96well plate에 BSA (0 250 500 1000 2000 ㎍/ml)10㎕, sample10㎕, BCA reagent 200㎕를 순서대로 넣어준다. 13. 37℃ 에서 20분간 incubation 한다. 14. Microplate reader로 562nm으로 측정 후, 정량곡선을 그린다. 15. 정량을 마친 후, 5X sample buffer를 넣고 95도에서 15분간 끓인다. 16. Ice에서 5분간 식힌 후, spin down한 다음, -20도 냉장고에 보관한다 BSA 250 500 1000 2000 Sample A B BCA reagent (A : B = 1 : 50)

Result 1.083 0.689 Bradford 용액 dosage 실험 결과 SDS-PAGE OD (y값) ug/ul (x값) X = (y-0.0732)/0.0583 로딩량 (uL) /30ug 30/x값 5X loding dye DW (or RIPA) 총볼륨 =20uL A 1.083 17.32075 1.7 4 14.3 20 B 0.689 10.56261 2.8 13.2 Bradford 용액

Discussion Q. Lowry method, Bradford method에 대해 알아보세요

Report 12+13+14 12/7 5시 까지 제출