벌꿀 중 옥시테트라사이클린 분석 식 품 약 품 분 석 과 윤 설 희

발 표 순 서 벌꿀 중 옥시테트라사이클린의 규격신설의 배경 HPLC법을 이용한 Oxytetracycline 분석 결 과

벌꿀 중 옥시테트라사이클린의 규격신설의 배경 벌꿀에서 항생제 검출 보도 제38호(2006.9.28) 벌꿀에서 항생제 검출 - 소비자시민모임, 23개 벌꿀 제품의 항생제 및 품질 검사 ■ 검사 결과 요약 벌꿀 제품 일부(56.5%)에서 항생제가 검출되었다. 소비자시민모임이 2006년 5월에서 9월 중순까지 시판되는 23개 벌꿀제품에 대해 항생제 검출 및 품질 검사를 홍콩소비자협회와 공동으로 실시한 결과, 13개 제품에서 항생제가 검출되었다. 품질 검사에 있어서는 8개 제품이 유럽 기준에 미달하였고 이 중 4개 제품은 우리나라 벌꿀의 기준 및 규격에 미달인 것으로 나타났다. ■ 13개 제품 (56.5%)에서 항생제 검출 절반이 넘는 13개 제품 (56.5%)에서 한 가지 이상의 항생제 (항생물질과 합성항균제인 설파제 등)가 검출되었다. 항생제가 검출되지 않은 제품은 모두 10개 제품이었다. • 모든 식품에서 검출되어서는 안 되는 클로람페니콜 검출 : 8개 벌꿀 제품 (35%)에서 식용동물에 사용이 금지된 항생제인 클로람페니콜이 검출되었다. 우리나라에서 클로람페니콜은 소고기, 닭고기, 어류, 돼지고기, 갑각류 등에 검출되어서는 안 되도록 규정하고 있다. 유럽연합에서도 양봉업에 사용을 금지하고 있는 항생제이다. • 한 제품에서 여러 종류의 항생제 검출 : 5개 벌꿀제품에서는 클로람페니콜을 비롯해 퀴노론, 스트렙토마이신, 설파제 등 4가지 이상의 항생제가 검출되기도 하였다.

벌꿀 중 옥시테트라사이클린의 규격신설의 배경 꿀벌에서 주로 발생되는 질병 : 부저병, 노제마병, 백묵병 등 양봉업계에서는 세균성질병인 부저병 치료 목적으로 테트라사이클린계 약제를 설탕과 섞어 사용하고 있다. 이러한 항생제를 과다하게 사용 할 경우 최종산물인 벌꿀에 약제가 잔류되어 항생제에 대한 내성의 증가, 알레르기의 유발 등 부작용을 야기할 우려.

식품의약품안전청 고시 개정 고시 : 제 2007-26호(2007년 5월7일) 개정이유 주요내용 벌꿀에서 항생물질의 잔류허용기준 규정을 신설하여 국민에게 안전한 식품을 제공하고자 함 주요내용 - 벌꿀 중 옥시테트라싸이클린 잔류허용기준 신설 : 0.3㎎/㎏ 이하 벌꿀 중 옥시테트라싸이클린 시험법 신설 ※ 벌꿀에 대한 동물용의약품의 잔류허용기준 강화 식품의약품안전청고시 제2007-68호(2007.10. 8.) - 클로람페니콜(Chloramphenicol) : 불검출(2008.4.1 시행) - 네오마이신(Neomycin) : 0.1㎎/㎏ 이하 (2008.1.1 시행) - 디히드로스트렙토마이신/스트렙토마이신(Dihydrostreptomycine/streptomycin) : 불검출 (2008.1.1 시행) - 아미트라즈(Amitraz) : 0.2㎎/㎏ 이하 (2008.1.1 시행) - 코마포스(Coumaphos) : 0.1 ㎎/㎏ 이하 (2008.1.1 시행) - 플루메쓰린(Flumethrin) : 0.01㎎/㎏ 이하 (2008.1.1 시행) - 플루발리네이트(Fluvalinate) : 0.05㎎/㎏ 이하 (2008.1.1 시행)

벌꿀 중 옥시테트라사이클린에 대한 규제현황 Table 1. Maximum residue limits(MRL) of Oxytetracycline in honey EU 칠레 캐나다 호주 대한민국 MRL (㎍/㎏) 25 80 300

Oxytetracyclines 그람음성균, 그람양성균 및 마이코플라스마에 대한 정균효과 우수  장내세균 감염증, 호흡기 질병, 아나플라스마 감염증, 타일레리아 감염증 현재 사용되는 항생제 중 치료 및 사료첨가제로 가장 많이 사용

Oxytetracycline 분석법 시료전처리법 고체상추출법(Solid Phase Extraction : SPE) : Liquid형태의 시료를 고체상(흡착제)에 흘려주어 용질을 흡착시킨 후 원하는 용질만을 선택적으로 용출시키는 방법 액상추출법(Liquid-Liquid Extration) : 화합물의 용해도 차이를 이용하여 액상의 추출용매에서 유기용매층으로 전이시켜 추출하는 방법으로 유기용매의 사용량의 많으나 시료를 다량 사용하여 농축할 경우 미량도 검출해 낼 수 있다. 시료고체상 분산처리법(Matrix Solid Phase Dispersion : MSPD) : 시료와 고체상인 분말을 직접 갈아서 반응시킨 후 유리컬럼에 옮겨 탈지하고 적합한 용출용매로 원하는 물질을 용출시키는 방법으로 유기용매의 사용량이 적고 방법이 간단하고 처리시간이 짧다는 장점이 있으나 시료의 양이 적어 액상 추출법에 비해 극미량은 검출하기 힘들어 스크리닝 방법으로 적당하다

Oxytetracycline 분석법 정량법 High performance liquid chromatography(HPLC) : 식품공전상 정량법 Capillary high performance liquid chromatography High performance liquid chromatography-mass spectrometry(HPLC-MS)

HPLC 법을 이용한 정량검사 측정기기 : 액체크로마토그래피/자외부흡광광도검출기 시약 및 시액 - 표준용액 조제 : Oxytetracycline(OTC) 표준품을 정밀히 달아 메탄올에 녹여 표준원액(Stock Solution- 100㎍/㎖)을 만들어 적당한 농도로 희석하여 사용. - 맥바인 완충용액 : 구연산 11.8g + EDTA·2Na 33.62g + 제이인 산나트륨 13.72g⇒ 증류수 1ℓ에 녹임. - HLB(Hydrophilic Lipophilic Balance) Cartridge : 역상흡수제

HPLC 법을 이용한 정량검사 시험용액 조제 Inject into HPLC ▶ 정제 ▶ 정제 ① HLB카트리지 : 잔류물은 메탄올 2㎖에 녹인 후 Filter with 0.2㎛ membrain filter ▶ 정제 ① HLB카트리지 : Pretreatment with methanol 8㎖, DW 8㎖=>활성화 ▶ 추출 Sample 5g + 20% 삼염화초산 2㎖+ McIlvain완충용액 20㎖ ⇒ 원심분리하여 상등액 여과 추출 Inject into HPLC ▶ 정제 40℃이하의 수욕중에서 감압농축 ▶ 정제 ② absorption of Extrat solution ③ Washing with 5% Methanol ④ Elution with 0.01M Oxlic Acid-Methanol

Table 1. Analytical conditions for High performance liquid chromatography HPLC Dionex UVD 170U Column Capcellpak C18(4.6*250mm, 5㎛) Detector UV Wave Length 365nm Mobile phase Injection volume 10ul Flow rate 1.0 ml/min 0.01M Oxalic acid ACN 구성비(%) 80 20

Figure 1. Chromatogram of Oxytetracycline standards (1 mg/kg) 결 과 1. HPLC 크로마토그램 Mobile Phase 0.01M Oxalic acid : ACN = 80 : 20 Flow rate 1.0ml/min Figure 1. Chromatogram of Oxytetracycline standards (1 mg/kg)

Figure 2. Chromatogram of five Oxytetracycline standards 결 과 2. HPLC 의 농도별 표준곡선 Figure 2. Chromatogram of five Oxytetracycline standards

결 과 2. HPLC 의 농도별 표준곡선 Fig3. Standard calibration Curves 결 과 2. HPLC 의 농도별 표준곡선 : 표준용액을 각각 0.5 ~ 10㎎/kg의 농도범위에서 HPLC에 주입하여 자외선 검출기로 측정하였을때 상관계수 0.999이상의 양호한 직선성을 나타냄 (Fig.3). Fig3. Standard calibration Curves

Figure 4. Chromatogram of Oxytetracycline in spiked honey 결 과 3. Recovery of Oxytetracycline in spiked honey Sample 1 mg/kg 2 mg/kg 4mg/kg Figure 4. Chromatogram of Oxytetracycline in spiked honey

Recovery rate(%, mean ±S.D.), n=3 결 과 3. Recovery of Oxytetracycline in spiked honey Table2. Recovery rate of Oxytetracycline in spiked honey Recovery rate(%, mean ±S.D.), n=3 1 ㎎/kg 2 ㎎/kg 4 ㎎/kg Mean Oxytetracycline 84.2±7.3 108.3±2.0 106.3±4.4 99.6±6.8 ※ S.D. : Standard deviation

결 과 4. 벌꿀 중 옥시테트라사이클린계 약제 잔류 0.01㎎/kg 검출. 결 과 4. 벌꿀 중 옥시테트라사이클린계 약제 잔류 : 9월 수거식품 벌꿀 11개제품 중 2개의 제품(20%)에서 0.01㎎/kg 검출.

감 사 합 니 다.