효소를 이용한 간 기능 검사

실험 목적 GOT • GPT를 이용한 간 기능 검사 생체에서 단백질 합성, 포도당 및 탄수화물 대사, 핵산 대사, 지질 대사, 약물 대사 등을 담당하는 중요한 기간인 간은 여러 질환들로 인해 손상 될 수 있다. 간 손상을 정확히 진단하기 위해 효소를 이용한 생화학적 방법들을 통하여 간 기능 검사를 진행하여 본다. 주요 검사로는 AST(GOT), ALT(GPT) 등이 있다.

Introduction GOT • GPT Aminotransferase(transaminase)의 활성 측정 : aminotransferase는 keto acid와 amino acid 간 amino 기의 교환을 촉매하는 효소 ① AST(aspartate aminotransferase) = GOT (glutamic oxaloacetic transaminase) ② ALT(alanine aminotransferase) = GPT (glutamic pyruvate transaminase) 간세포 내에 존재하는 효소들로 주로 간세포가 손상을 받는 경우에 혈중으로 방출되어 혈중 수치가 증가하게 된다. 급성 간세포 손상 초기에는 간 세포 내 농도가 높은 AST가 ALT보다 더 많이 증가하지만 24~48시간 뒤에는 반감기가 긴 ALT가 더 높아진다. 알코올성 간염에서는 AST가 더 증가하고, 만성 간세포 손상에서는 ALT가 더 높다.

Introduction AST(=GOT) ALT(=GPT) GOT • GPT Aspartate + α-ketoglutarate → glutamate + oxaloacetate oxaloacetate + dinitrophenylhydrazine → hydrazone 생성된 colored hydrazone을 spectrophotometer로 측정 ALT(=GPT) Alanine + α-ketoglutarate → glutamic acid + pyruvate pyruvate + dinitrophenylhydrazine → hydrazone 생성된 colored hydrazone을 spectrophotometer로 측정

Materials & Methods GOT • GPT GOT용 기질액, GPT용 기질액, NaOH, 정색시약, 검량선용 시약, 마우스 혈청, water bath, spectrophotometer, vortex mixer ▶ 표준곡선 작성 1. 시험관 번호 1~5의 순서대로 검량용 시약을 0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4ml씩 분주한다. 2. GOT 기질액 또는 GPT 기질액을 순서대로 1.0, 0.9, 0.8, 0.7, 0.6ml씩 분주한다. 3. 각각의 시험관에 증류수 0.2ml, 정색시약 1ml씩 분주한다. 4. 0.4N NaOH를 10ml씩 분주하여 잘 혼합한 후 실온에서 10분간 방치한다. 5. 증류수를 대조로 하여 spectrophotometer의 파장 505nm에서 흡광도를 측정한다. 6. Transaminase 활성치의 단위를 X축, 흡광도를 Y축으로 하고 각각의 흡광도 실측치와 그에 해당하는 transaminase 단위와의 대응점을 연결하여 GOT 및 GPT용 표준곡선을 작성한다.

Materials & Methods GOT • GPT GOT용 기질액, GPT용 기질액, NaOH, 정색시약, 검량선용 시약, 마우스 혈청, water bath, spectrophotometer, vortex mixer ▶ 시료 측정 작성 1. GOT/GPT 기질액 각 1ml을 37℃ waterbath에서 5분간 가온한다. 2. 마우스 혈청 10ul를 각 기질액에 섞어 37℃ waterbath에서 GOT는 60분, GPT는 30분간 가온한다. 3. 정색시약 1ml과 잘 혼합한 후 실온에서 20분간 방치한다. 4. 0.4N NaOH 10ml과 혼합한 후 실온에서 10분간 방치한다. 5. 증류수를 대조로 하여 spectrophotometer의 파장 505nm에서 흡광도를 측정한다.

Materials & Methods GOT • GPT GOT용 기질액, GPT용 기질액, NaOH, 정색시약, 검량선용 시약, 마우스 혈청, water bath, spectrophotometer, vortex mixer ▶ 측정상의 주의 사항 1. 0.4N NaOH 10ml을 넣을 때는 5초 이내에 분주할 수 있는 구멍이 큰 것을 사용 한다.  Serological pipet & pipet aid 이용 2. 혈청을 넣을 때는 정확도가 높은 마이크로 파이펫을 사용한다. 3. 효소 반응의 온도 및 시간을 정확히 취한다. 4. 표준 곡선에서 벗어나는 높은 치를 나타내는 혈청에 대해서는 생리식염수로 정확히 희석하여 얻은 측정치에 희석배수를 곱하여 준다.

기질액 (GOT/GPT) 1ml 혈청 10ul 정색시약 1ml 0.4N NaOH 10ml 60분 이내에 505nm(490~530nm) 파장에서 증류수를 대조로 흡광도 측정 37℃ 5분 37℃ GOT : 60분 GPT : 30분 실온 20분 혼합 실온 10분

Results 측정한 시료의 흡광도를 표준곡선에 대입하여 구해보고, 나온 값이 정상치인지 확인한다. GOT • GPT 정상치 GOT : 8~40 karmen 단위 GPT : 5~30 karmen 단위