헤마톡실린과 에오신염색

Hematoxylin 염색 숙성(ripening)과정: HgO (mercuric oxide), NaIO3(sodium iodate) 산화제 첨가 hematein lake가 형성: 매염제가 첨가되면 hematein내의 OH 기와 금속이온 사이에 정전기적 결합이 일어나고, hematein 산소 원자가 금속이온과 배위결합(coordinate bond)하여 오각형의 고리(AI-O=C-C-O)가 형성되면서 안정한 구조인 hematein-mordant Complex 형성 핵 염색: lake는 양(+)으로 하전되며, 조직성분 중 음 (-)의 성질을 띤 부위 (세포핵 등)와 이온결합하여 청자색 내지 청색으로 염색 그림 7-6. 헤마톡실린의 염색기전

헤마테인 레이크 (hematein lake) 헤마톡실린 그림 7-5. 헤마톡실린용액. 알코올에 헤마톡실린만 녹인 용액(왼쪽)과 산화제와 매염제를 첨가한 후 헤마테인 레이크(hematein lake)가 형성된 용액(오른쪽)

Hematoxylin의 매염제 Hematein이 조직 구조에 대한 친화력이 약하기 때문에 매염제가 같이 사용 조직검사실에서는 매염제로 aluminium과 iron을 주로 이용 Iron과 ferric salt는 산화제와 매염제의 기능을 갖고 있어 산화제를 첨가하지 않는다.

1) 명반(Aluminum) hematoxylin 핵염색액으로 널리 이용 조직표본에서 정상핵과 비정상핵을 잘 구별 Dye-mordant lake는 조직과 결합할 때 초기 정전기적 결합에서 공유결합으로 전환되어 결합력이 강해 alcohol 처리에도 저항성이 있다. 대부분의 alum hematoxylin 용액의 pH는 2.2~2.9 범위 (핵산의 등전점이 pH 1.5~2.0) 1) 명반(Aluminum) hematoxylin

명반(Aluminum) hematoxylin 종류 Harris hematoxylin 산화제 : Mercuric oxide 핵 염색이 명확히 나타나 검사실에서 가장 많이 사용 퇴행성 염색으로 사용 Mayer hematoxylin 산화제 : Sodium iodate 진행성 염색으로 사용 특수 염색에서 핵을 대조 염색하는 경우 이용

Delafield hematoxylin 마개를 하고 3~5일간 빛과 공기에 노출하여 자연숙성시켜 산화시킨 후 여과 Ehrlich hematoxylin 2주 이상 공기중에서 산화 Gill hematoxylin (#1, #2, #3) 산화제 : Sodium iodate Carazzi hematoxylin 산화제 : Potassium iodate

빙초산(glacial acetic acid)의 기능 Alcohol의 기능 곰팡이(진균류)의 증식을 억제시키는 보존제 Glycerol의 기능 과산화를 막아주며, 용액의 증발을 방지 빙초산(glacial acetic acid)의 기능 핵염색의 선택성을 증진시키고 과산화작용을 완화하며, 산화제의 기능을 촉진하여 보다 좋은 염색성을 나타내도록 하는 염색 강화제(보강제)

철 (Iron) hematoxylin Alum 다음으로 핵염색에 많이 쓰이는 매염제 산화제와 매염제의 두 작용을 공유 Ferric chloride와 ferric ammonium sulfate가 많이 사용 자주 hematoxylin 염색의 탈색액(2% ,염화제이철; 탄력섬유염색-베르헤프 철헤마톡실린)으로도 이용

일반 염색보다 특수염색의 핵염색에 사용 -염색과정에 산성용액이 있는 경우, 명반 hematoxylin은 염색력이 약화되기 때문 가장 주의해야 될 것은 산화 - 매염제와 hematoxylin 용액을 분리하여 두었다가 사용 전, 즉시 혼합 (Weigert's hematoxylin)하여 염색하거나 따로 분리하여 사용(Heidenhain hematoxylin)

철 (Iron) hematoxylin 종류 Weigert iron hematoxylin Ferric chloride를 매염제와 산화제로 동시에 사용 산성염료의 대조염색으로 사용 (아교섬유염색) Heidenhain hematoxylin Ferric ammonium sulfate를 산화제와 매염제로 동시에 사용 Verhoeff's hematoxylin 탄력섬유의 증명에 이용

기타 hematoxylin Tungsten hematoxylin Tungsten (1% phosphotungstic acid)을 매염제로 사용하며, Mallory PTAH염색(횡문근, 섬유소염색)에 사용 그 외 Loyez, Molybdenum, Lead , Bohmer, Bullard hematoxylin 등

Ferric sulfate, Ferric alum Type of hematoxylin Hematoxylin의 종류 매염제 산화제 Harris Alum(NH4, K) Murcuric oxide Mayer Sodium iodate Gill Carazzi Ehrlich, Delafield O2 Verhoeff Ferric chloride - Weigert Heidenhain Ferric sulfate, Ferric alum Mallory PTAH Phosphotungstic acid O2, pot.permanganate

Before filtration After filtration Hematoxylin의 산화 산화물에 의해 염색액의 표면에 금속성 막 형성 사용 전, 반드시 여과하여 산화막 제거 그림 7-7. 헤마톡실린용액 표면의 금속성 막 제거. A. 헤마톡실린용액의 여과 전 B. 여과 후 Before filtration After filtration

헤마톡실린 염색의 분별과 청색화 분별(differentiation) Harris hematoxylin은 퇴행성 염색법에 사용하므로 과염색한 후 1% HCl-alcohol 용액으로 감별 alum hematoxylin은 pH가 2.95 정도이므로 acid alcohol 용액으로 분별하면 붉은색을 나타낸다.

Harris hematoxylin의 감별 기전 - 세포질의 헤마톡실린 제거

핵의 청색화 (blueing:중화) Alum은 용해되면 해리되어 aluminium과 수용액 내의 –OH기가 결합하여 불용성의 aluminium hydroxide, Al(OH)3을 형성 수용액 내에 많은 양의 산이 존재하면 aluminium hydroxide가 형성되지 않고 OH이온의 결핍으로 인해 alum hematoxylin도 불용성의 dye lake를 형성할 수 없게 되어 산용액 내의 alum hematoxylin은 적색으로 변화 청색화하기 위해서는 유리 산(free acid)을 중화시킬 수 있는 hydroxyl 기 (알칼리 용액)을 첨가

pH 8.0 ammonium hydroxide 용액이나 lithium carbonate 용액 중탄산나트륨 또는 칼륨용액 가온된 수돗물 사용 pH 8.0 ammonium hydroxide 용액이나 lithium carbonate 용액 중탄산나트륨 또는 칼륨용액 암모니아수(0.5~1% ammonia/ 80% 에탄올) pH 8.2 Scott’s tap water 등을 사용 그림 7-9. 청색화제(bluing agents) 종류에 따른 핵 염색성의 차이. 청색화제의 pH에 따라 핵 염색성이 적자색으로부터 짙은 청색까지 다르게 변화한다.

Eosin 염색용액 (세포질 염색액) Eosin 염색용액은 hematoxylin에 염색되지 않은 나머지 부분에 옅은 적색으로 염색 핵의 청색이 주위의 적색과 대조되어(contrast) 더욱 잘 보일 수 있도록 하기 위한 목적으로 시행하는 염색 세포질 염색액은 대개 산성 염료이며 조직구조의 염색은 eosin Y가 주로 사용 RBC, muscle fiber, 세포질 등을 pinkish- red로 염색

Eosin 염료 alcohol 보다 물에 대한 용해도가 대단히 높다. 하전 되어 있어서 조직 내의 양(+)으로 하전된 성분과 결합 단백질의 총 전하를 양(+)으로 변화시키기 위해서는 eosin 수용액의 pH를 6.0 이하로 낮춰야 하기 때문에 초산(acetic acid)를 소량 첨가하여 용액의 pH를 조절 Eosin의 pH는 약 4.6~5.0 사이에서 가장 좋은 염색성

피부의 HE염색표본 A. 에오신의 pH가 너무 높은 경우. B. pH 4.6~5.0의 약산성의 에오신에서 염색한 경우

Harris H&E stain Xylene 3분 100% EtOH 1분 95% EtOH 80% EtOH 수돗물 15회 침적 Harris Hematoxylin 2분 1% HCl-EtOH 2회 침적 Ammonia수 Eosin 건조 (흄후드) 10분 봉입

자동염색기(autostainer) 그림 7-13. 자동염색기(autostainer)

일반염색과정 1) 박절 후 절편을 60℃ oven에 1 시간 정도 녹인다. 2) 탈 paraffin 과정 조직내부에 침투된 paraffin과 조직 외부에 포매된 paraffin을 제거하는 과정 주로 xylene이 사용 박절표본은 뿌옇게 보이는 것은 완전히 건조되지 않아 물이 xylene에 혼합되었기 때문 일반염색과정

3) 함수과정 고농도의 alcohol로부터 저농도의 alcohol을 단계적으로 거친 다음 수세하는 것으로 이 과정의 목적은 염색용액이 대부분 수용액 상태이기 때문 4) 염색 5) 탈수 및 투명과정 단계적인 탈수와 xylene으로 투명 Xylene 투명과정을 다 거치면 조직절편은 투명하게 보여야 하며, 만약 절편이 혼탁하게 보이는 것은 탈수가 불완전한 것

stain jar & rack

핵산 염색 (nucleic acid staining)

그림 14-1. 염색체 내에 농축되어 들어 있는 DNA 구조

그림 14-2. 뉴클레오티드(nucleotide). 염기, 오탄당, 인산으로 이루어져 있다.

DNA staining - 조직절편에서 DNA를 증명하는 염색법 Feulgen 반응 DNA를 구성하는 deoxyribose가 가수분해하여 유리되는 aldehyde기를 이용하는 염색법 methyl green – pyronin 법 인산기가 산성 pH에서 염기성 염료인 methyl green과 결합하는 방법을 이용하는 염색법 형광염색법 acridine orange를 이용한 염색법 (DNA : 녹색형광, RNA : 적색형광) gallocyanin chrom alum 방법 추출 기법을 사용 in situ hybridization - 가장 민감 DNA staining

Feulgen reaction 조직절편 내의 DNA를 증명할 수 있는 방법 조직절편에 약산(1N HCl)을 가하여 60℃에서 가수분해를 시키면 DNA로부터 deoxyribose와 결합되어 있던 purine염기(adenine, guanine)가 분리되며(purine-deoxyribose 결합이 분해), deoxypentose 당으로부터 aldehyde기가 유리 유리된 aldehyde기는 무색의 Schiff 시약과 반응 Feulgen reaction

그림 14-7. 포일겐 반응(Feulgen reaction)의 원리

고정과 기법 방법 Carnoy 용액 또는 10% neutral beffered formalin이 우수 Bouin 용액은 핵산을 과산화시키는 경향이 있으므로 사용 불가능 방법 Xylene 에 deparaffination, rehydration Distilled water에 잠깐 동안 washing 1N hydrochloric acid(HCl) solution에 1분간 처리 30분전에 미리 60℃ oven에 넣어둔 1N HCl solution에 8~12분 정도 두어 가수분해 증류수로 3분씩 3회 수세 Schiff reagent에 실온에서 40~60분간 반응 Sulfurous rinse solution에 2분씩 3회 처리 흐르는 물에 10분간 수세 Light green solution에 1~2분간 대조염색 Dehydration. clearing. Mounting

Result Nucleic acid (DNA) ---- magenta(적자색) 세포질 ----------------- green Background ---------- green

MG-P (methyl green-pyronine) 조직절편 내의 DNA와 RNA를 증명 형질세포의 증명에 이용 다발성골수종(multiple myeloma), 형질세포종(plasmocytoma)의 증명(Russell body)에 유용 2개의 양이온 염료(cationic dye)를 조절된 농도와 pH(pH4.8)에서 동시에 적용하는 방식 Methyl green: 염기성 염료로 약한 산성 pH에서 DNA의 인산기에 특이적으로 결합해 청녹색으로 염색 Pyronine: RNA에 대해 비특이적으로 분홍 또는 적색으로 염색 MG-P (methyl green-pyronine) DNA & RNA staining

Result DNA ------------------------------------ green-blush green RNA ------------------------------------ red-rose red Other tissue component ----------- pale pink~colorless pH4.8 pH1.5 pH9.0

Pyronin (럿셀소체) Methyl green (핵) MGP in plasmacytoma x400

methyl green은 chloroform으로 정제 후 사용 4℃ Carnoy 용액의 고정이 우수

피로닌 Y의 얇은막크로마토그래피상 그림 14-13. 여러 회사에서 시판된 피로닌 Y의 얇은막크로마토그래피상. 일부 회사제품에서 피로닌 Y 성분이 포함되어 있지 않은 것도 있다. P : 피로닌 O : 시작점

아크리딘오렌지(acridine orange) 염색 원리 그림 14-14. 아크리딘오렌지(acridine orange)의 염색 원리. 이중 나선구조 사이의 염기쌍 사이로 끼어들어가 결합한다.

봉입(Mounting) 염색표본을 명확히 관찰하기 위해서 slide와 굴절률 이 유사한 점도가 높고 투명한 매질을 떨어뜨린 후 cover glass를 덮어 영구보존 하기 위해 봉입(Mounting)

봉입 목적 염색표본의 물리적 손상방지 및 산화에 의한 퇴색방지(염색성에 변화를 주지 않기 위해) 조직절편의 부패방지 표본을 오래 투명하게 유지 봉입 목적

봉입제가 갖춰야 할 조건 봉입제의 굴절률(refractive index)이 조직의 평균 굴절률인 1.530~1.540에 가까워야 하고 slide 위에 부착한 조직절편과 cover glass 사이에 고르게 펴져야 하며 비교적 짧은 시간에 굳어져야 하고 무색 투명해야 하며 접착력이 있어야 한다. 기포가 잘 빠져야 한다. pH가 중성 (염색 결과에 영향을 주어서는 안되므로)

1) 수용성 봉입제의 종류 Glycerin jelly(glycerol gelatin) Glycerol(glycerin) Mineral oil(liquid paraffin) Glycerin jelly(glycerol gelatin) 봉입 후 단단히 굳힌 후에 coverslip의 가장자리를 메뉴큐어로 잘 밀봉하여 두면 몇 년간 염색 표본의 보존이 가능 Apathy gum syrup Levulose(fructose) syrup 1) 수용성 봉입제의 종류

지방염색 지방은 alcohol에 용해되므로 탈수과정 없이 봉입 amyloid(유전분체)의 이염색성 염색, 변색성 염색 alcohol이나 xylene 등에 의해 퇴색되며, 변색성 염색을 한 후 비수용성 봉입제로 봉입하면 염색성이 정색성으로 변화하기 때문 면역형광법을 이용하는 검사 조직 내의 효소 검출 시(효소조직화학검사) 염색 후, 탈수나 투명과정 없이 바로 봉입 영구 보존 어렵다.

2) 비수용성 봉입제 영구보존 가능 Canada balsam (굴절률 1.541~1.547) 천연수지 봉입제 천연수지는 완전히 굳는데 2~3개월 걸리며, 오래되면 황색 용매가 증발하고 나면 균열이 발생 장기간 보관할 경우 천연수지에 포함되어 있는 산성성분이 염색 색조를 퇴색시키는 단점 종류 Canada balsam (굴절률 1.541~1.547) Gum dammer

합성수지(synthetic resin) 봉입제 주로 β-pinene polymer로 이루어졌다. 장점 화학조성을 알 수 있으며 안정되고 순수 휘발성 유기용매에 쉽게 용해 색상이 투명하며, 오랜 시간이 지나도 황색변화가 발생하지 않는다. 1 시간 이내에 건조 조직절편과 슬라이드의 굴절율이 동일한 굴절율(Rf=1.53~1.54)

합성수지 봉입제의 종류 Permount : 굴절률 1.529 Eukitt : 굴절률 1.510 Harleco synthetic resin : 굴절률 1.548 Permount : 굴절률 1.529 Bioloid : 굴절률 1.550 Histoclad : 굴절률 1.560 Caedax

봉입의 방법 봉입제의 양이 적으면 기포가 생기기 쉽고, 후에 봉입제가 건조되면서 공기가 들어가면 표본의 질이 떨어진다. 봉입제의 양이 너무 많으면 봉입제가 cover glass 밖으로 새어 나와 slide가 지저분하게 되고 현미경 검경 시 뿌옇게 보이므로 이때는 여과지에 slide를 세워 여액을 흘려 보내고 xylene을 묻힌 gauze로 가장자리를 닦아낸다.

조직표본에 xylene이 말랐을 경우, xylene에 담궈 두었다가 다시 봉입 작은 기포들이 생겼을 때는 예리한 forcep으로 가만히 눌러 빼낸다. (Forcep으로 눌러도 잘 빠지지 않는 것은 xylene 용액에 담그어 두었다가 cover glass를 떼어내고 다시 봉입) 지방 염색 후 수용성 봉입제로 봉입할 때는 기포가 생겼다고 forcep으로 눌러주면 지방방울의 위치가 변할 수 있으므로 눌러서는 안된다.