Lecture 8 Hemoglobin, Hematocrit, RBC Indices Keohane EM, Smith LJ, Walenga JM Rodak Hematology 5th Ed, 2016, Chapter 14 Elaine M. Keohane, PhD, MLS keohanem@umdnj.edu University of Medicine and Dentistry of New Jersey School of Health Related Professions and Kyung Jin Cho, PhD chokj@korea.ac.kr Korea University, College of Health Sciences Apr 26, 2019

Hemoglobin Determination CyanmetHb method

Cyanmethemoglobin 측정법 EDTA처리 정맥혈액 또는 헤파린처리모세관혈액 Drabkin 용액은 RBC용해하여 Hb 방출 √ Drabkin solution: NaHCO3, K3Fe(CN)6, KCN CyanmetHb의 흡광도는 Hb농도에 그대로 비례 함 √ Ferrous (Fe2+) Hb Potassium ferricyanide (K3Fe(CN)6) MetHb (Fe3+) MetHb (Fe3+) Potassium cyanide (KCN) √ Cyanmethemoglobin (540 nm에서 비색)

Cyanmethemoglobin 측정법 - 계속 Spectronic 20D+ https://www.youtube.com/watch?v=jmZomizSPxw

Cyanmethemoglobin 측정법 - 계속 Spectronic 20 부위설명 1. Sample compartment 2. Digital readout 3. Mode indicators 4. Mode selection 5. Decrease 6. Increase 7. Print 8. Wavelength control 9. Transmittance/Absorbance control (100%T/0A) 10. Power switch/Zero (0%T) Control 11. Filter lever

Cyanmethemoglobin 측정법 - 계속 Spectronic 20 캘리브레이션 (1) Turn on – 15 분 warm up (2) Wave length 설정 (3) Filter 위치 선택 (4) 0%T(투과도) 세팅 (5) 0%T 또는 A(흡광도)로 모드 설정 (6) Blank 큐벳 넣고 (7) 100% T or 0 A로 조정  (8) Sample 큐벳 넣고 (9) %T(투과도) 또는 A(흡광도) 수치를 읽는다 https://www.youtube.com/watch?v=jmZomizSPxw

표준검량선(Standard Curve) 준비 Cyanmethemoglobin 측정법 - 계속 표준검량선(Standard Curve) 준비 표준검량선 준비요령 (예): 20 g/dL 표준액 이용 시 √ CyanmetHb표준액: 기지농도(20) g/dL Hb Eq. 표준액. √ 아래 도표대로, CyanmetHb표준액과 Drabkin sol 이용하여 5단계 농도(blank, 5 g/dL, 10 g/dL, 15 g/dL, 20 g/dL) tube 준비 Drabkin sol으로 희석한 후의 각 표준 Hb농도(g/dL) Tube #1 0 g/dL (Blank) Tube #2 5 g/dL (1:4 dilution) Tube #3 10 g/dL (1:2 dilution) Tube #4 15 g/dL (3:4 dilution) Tube #5 20 g/dL (Undiluted) Hb 20 g/L Eq. Cyanmet Hb 표준액 0 mL 1.5 mL 3 mL 4.5 mL 6 mL Drabkin solution

Cyanmethemoglobin 측정법 - 계속 Semilog Paper for Hb Standardization Hemoglobin concentration (g/dL) Keohane EM et al., Rodak Hematology 5th Ed., p193

Cyanmethemoglobin 측정법 - 계속 표준검량선 - Drabkin sol blank (100% T) 를 기준으로 각 표준액에서의 투과도(%T) 값을 읽어 기록 Tr(%) read in each tubes blank : 100 % T 5 g/dL: 72.9% T 10g/dL: 53.2% T 15g/dL: 39.1% T 20g/dL: 28.7% T - Semilog paper에 X-축의 각 표준액 농도에서의 해당 %T값 들을, 각각 Y-축에 표시한 후, 검량선 완성 Fig 14-5: : Rodak, Fritsma, Keohane: Hematology: Clinical Principles and Applications, Elsevier items and derived items © 2012, 2007, 2003 by Saunders, an imprint of Elsevier, Inc p. 178 Hemoglobin Concentration (g/dL) % Transmittance Blank (Drabkin sol)

Cyanmethemoglobin 측정 환자검체 혈색소 측정 전혈을 √1:251로 Sahli pipette(Autopipette)이용하여 희석 (20 L 전혈 + 5 mL Drabkin용액): 0.02 mL+ 5.0 mL 혼합 후 10 분 방치 분광광도계에서 Drabkin용액 blank(100% T)를 기준으로 환자표본의 투과도(% T) 를 읽고 검량선을 이용하여 환자의 Hb치를 얻는다 ※ 주의사항 √ Drabkin 용액에는 cyanide 성분 있어; 만약 산과 섞이면 (싱크대에 산 성분이 남아 있을 때), hydrogen cyanide gas 생성: 실험 후 측정액은 폐액 통에 폐기해야 )

Cyanmethemoglobin 측정 - 계속 오류 원인 √ 거짓증가: 검체의 혼탁도 고지혈증 (Triglycerides > 1000 mg/dL) 백혈구증가증 (WBC > 20 x109/L) 혈소판증가증 (PLT > 700 x109/L) 용혈되지 않은 RBCs (Hb S 또는 Hb C가 많은 경우) 비정상글로불린 증가 거짓감소: CarboxyHb (HbCO) 또는 sulfhemoglobin 존재 (HbCo Cyanmet Hb 로 전환되려면 1시간 소요; Sulfhemoglobin – CyanMet Hb법으로 측정 안됨) 기술적 오류 Drabkin용액 변질- 빛에 민감 * Drabkin용액은 갈색병에 넣어 보관하며 실온에서 1주일 까지 안정; 일반적으로 냉암소에 보관해야)

Azidemethemoglobin 법 예: HemoCue - POCT 기기 혈색소측정 시약 함유하는 일회용 큐벳에 혈액검체를 모세관 현상으로 정량 채취- 시약내 함유성분과 역할: Sodium deoxycholate 는 적혈구 용혈시켜 Hb방출 Sodium nitrite는 Hb (Fe+2)를 산화시켜 met-Hb (Fe+3)로 전환 √ Sodium azide 는 metHb을 azide met-Hb로 전환 생성된 Azide met-Hb의 흡광도를 570 nm에서 측정 880 nm에서 sample turbidity의 흡광도를 별도 측정하여 570nm에서 측정한 표본흡광도 값에서 차감 함으로써 검체 혼탁으로 인한 간섭영향을 보정할 수 있음

HemoCue Hb 201+ System https://www.youtube.com/watch?v=a6lwJG8U5kA Fig.14-19. Rodak Hematology, Keohane ME. Et al., 5th Ed. 2016, p205

SLS-metHb 법 √ Sodium lauryl sulfate는 Hb을 SLS-metHb으로 전환 Sysmex 자동혈구계산장비에서 사용해 오고 있음 √ Cyanide와 같은 환경오염물질 산출을 고려하여 non-toxic 시약을 사용

√ Hemoglobin의 참고범위 Males: 13.5-18.0 g/dL 135-180 g/L Females: 12.0-15.0 g/dL 120-150 g/L Newborns: 16.5-21.5 g/dL 165-215 g/L

Microhematocrit Method Hct (PCV-Packed Cell Volume) √ 일정량의 전혈 중 적혈구가 차지하는 용적율(%) Fig.14-8 Rodak Hematology, Keohane ME. Et al., 5th Ed. 2016, p195 √ RBC layer only Plasma Buffy Coat (Mononuclear Cells, Plts) Whole Blood

Microhematocrit Method- 계속 Fig 14-7: Rodak, Fritsma, Keohane: Hematology: Clinical Principles and Applications, Elsevier items and derived items © 2012, 2007, 2003 by Saunders, an imprint of Elsevier, Inc p. 179 항응고제: EDTA or heparin 측정방법: 폴리에틸렌 모세관에 혈액검체를 채우고 한쪽 끝을 점토로 봉입하고, 10,000-15,000g(√ 11,000 rpm) 에서 5분 원침. 적혈구를 최대한 packing 하는 원침시간은 검사실에 따라 최적시간으로 결정 Microhematocrit reader plate를 이용하여 Hct 결과치를 읽는다 (buffy coat는 불포함) 두 개 표본 이용하여 측정하며, 두 개의 결과치에서 1% 이내로 일치해야

Microhematocrit Reader Microhematocrit Method- 계속 Microhematocrit Reader Fig 14-6: Rodak, Fritsma, Keohane: Hematology: Clinical Principles and Applications, Elsevier items and derived items © 2012, 2007, 2003 by Saunders, an imprint of Elsevier, Inc p. 179

Microhematocrit Method- 계속 √ 참고범위 Male 0.40-0.54 L/L 40-54% Female 0.35-0.49 L/L 35-49% Newborns 0.48-0.68 L/L 48-68%

Microhematocrit Method- 계속 거짓증가 √ Plasma trapping (낫적혈구빈혈, 구형적혈구증가증 등과 같은 비정상적혈구 존재 시 일어남); 이러한 질환은 원침(혈구의 Packig 과정에서 혈구들 사이에 혈장이 갇혀 헤마토크릿 증가로 나타남 탈수 – 수분소실은 혈장량을 감소시키는 결과를 나타냄 거짓감소 모세관 채혈시 간질액 (interstitial fluid) 혼입으로 약간의 헤마토크릿 감소를 나타냄

Microhematocrit Method- 계속 오류 원인 – 기술적 원인 거짓증가: 불충분한 원침 원침 후 모세관을 10분이상 방치 했을 때 측정 시 buffy coat를 포함시켰을 때 거짓감소 √ 진공튜브 채혈시 불충분한 채혈(short draw): – 상대적으로 과다한 EDTA는 혈구수축 유도 불완전한 모세관 sealing: 원침 시 적혈구 소실 모세관채혈에서 과도한 squeezing: 조직액의 혈액희석 √ Hemolysis 기타 microhematocrit reader에서의 Hct reading 오류

√ Rule of Three When RBCs are normocytic and normochromic: √ Hb = RBC x 3, Hct = (Hb x 3) ± 3 Example 1: Hb is 10 g/dL and the Hct is 29%; [10(Hb) x 3] + 3 = 30 + 3 (Hct%) You expect the Hct to be between 27% and 33% The Hct is 29% so the Hb and Hct correlate Example 2: Hb is 11 g/dL and the Hct is 40%; [11 (Hb) x 3] + 3 = 33 + 3 You expect the Hct to be between 30% and 36% if Hct is 40%, so the Hb and Hct do not correlate

RBC INDICES: MCV, MCH, MCHC

RBC Indices(적혈구지수) MCV (평균적혈구용적): 적혈구용적의 평균치 √ MCV = Hematocrit (%) x 10 RBC (x 1012/L) 해석: √ 80-100 fL Normocytic < 80 fL Microcytic > 100 fL Macrocytic < 50 or > 150 fL Error fL = femtoliter = 10–15 L Femto = 10 -15 pico is 10 -12

적혈구지수와 혈액도말상 RBC모양의 상관성 MCV: Normocytic: 80-100 fL RBCs are normal in size (6-8 m) Microcytic: < 80 fL RBCs are smaller (< 6 m) Macrocytic: > 100 fL RBCs are larger (> 8 m)

MCH (평균적혈구혈색소량): 적혈구 한 개가 갖고 있는 평균혈색소 량 pg = picogram = 10–12 g RBC Indices – Cont’d MCH (평균적혈구혈색소량): 적혈구 한 개가 갖고 있는 평균혈색소 량 √ MCH = Hemoglobin (g/dL) X 10 RBC (x 1012/L) 해석: √ 26-32 pg Normal pg = picogram = 10–12 g Femto = 10 -15 pico is 10 -12

MCHC (평균적혈구혈색소농축도): 적혈구 한 개내 들어있는 평균혈색소농축도 RBC Indices – Cont’d MCHC (평균적혈구혈색소농축도): 적혈구 한 개내 들어있는 평균혈색소농축도 √ MCHC = Hemoglobin (g/dL) X 100 Hematocrit (%) 해석: √ 32-36 g/dL (%) Normochromic < 30 g/dL Hypochromic 36-38 g/dL Spherocytic √ > 38 g/dL 불가능 Femto = 10 -15 pico is 10 -12

적혈구지수와 혈액도말상 RBC모양의 상관성 MCHC: Normochromic: 중앙창백부위가 세포직경의 1/3 수준 √ Hypochromic: 중앙창백부위가 세포직경의 > 1/3 수준 Spherocytic:주중앙창백부위가 나타나지 않음

Normocytic, Normochromic Macrocytic Microcytic, Hypochromic Correlation of Indices to RBC Appearance on Blood Smear – Cont’d √ Normocytic, Normochromic Macrocytic Microcytic, Hypochromic MCV and MCHC = Normal MCV and MCHC = Decreased MCV = Increased

Spherocyte MCHC = 36-38 g/dL Correlation of Indices to RBC Appearance on Blood Smear – Cont’d Spherocyte MCHC = 36-38 g/dL

적혈구지수 계산 - Example MCV = 36 x 10 = 90 fL 4 MCH = 12 x 10 = 30 pg 4 √ 어떤 환자의 CBC결과 중 다음과 같은 data를 얻었다. 환자결과: RBC count of 4.0 x 1012/L(x 106/μL), Hb of 12 g/dL, Hct of 36%. 이 환자의 MCV, MCH, MCHC는? MCV = 36 x 10 = 90 fL 4 MCH = 12 x 10 = 30 pg 4 MCHC = 12 x 100 = 33.3 g/dL 36

Red Cell Distribution Width(적혈구분포폭) 적혈구분포포폭(RDW)는 적혈구용적분포의 CV값 임 √ 참고범위 : 11.5-14.5% 계산:√ RDW = SD of RBC volume x 100 MCV √ RDW증가는 대소부동형증과 관련있음 (혈액도말상 적혈구크기의 변화) RDW가 증가하는 경우: √ Iron, Vit B12 and/or folate deficiency Hemolytic anemias Anisocytosis

Red Cell Distribution Width and RBC Histogram # cells 90 fL 70 fL 110 fL MCV Normal variation in size Distribution of RBC volume between 80 and 100 fL

RDW and RBC Histogram # cells # cells Normal MCV Normal RDW Normal MCV 90 fL 70 fL 110 fL # cells Normal RDW # cells 90 fL 70 fL 110 fL Normal MCV Increased RDW

RDW and RBC Histogram # cells Decreased MCV Normal RDW Increased RDW 90 fL 70 fL 110 fL Decreased MCV Normal RDW Increased RDW Increased MCV Normal RDW 90 fL 70 fL 110 fL Increased RDW 35