Molecules Sang-Jae Lee 교목-소나무 교화-철쭉 교조-매 미생물 해양생물 Microorganism Plant Molecules Animal Lab. of E-F Biotech. Sang-Jae Lee

천연물질 연구는 활성성분의 분리, 정제 및 구조동정이 필수적임 천연물화학 이란? Natural Products Chemistry 천연물화학 생물체(동∙식물 및 미생물) 내 생합성 축적된 유기화합물을 중점으로 연구하는 학문 천연물: 1차대사물(primary metabolite) / 2차대사물(secondary metabolite) 천연물화학 연구법 분리 상호보완 화학구조 시너지 대사∙분포 상호보완 생합성 시너지 생리활성 Isolation Chemical Structure Metabolism Distribution Biosynthesis Bioactivity 시너지 상호보완 시너지 상호보완 천연물질 연구는 활성성분의 분리, 정제 및 구조동정이 필수적임 적외선분광기(IR) 자외선분광기(UV) 핵자기공명분광기 (NMR) 질량분석기(MS) PC/TLC 종이/박막 크로마토그래피 GC 가스 크로마토그래피 HPLC 고속액체 크로마토그래피

천연물화학(바이오-식품/화장품 소재) biological & Physiological active substance (Bioresource) 펩타이드 아미노산 지방산 천연감미료

천연물화학(바이오-의약/기타 소재) biological & Physiological active substance (Bioresource) 단백질치료제 항생제 항암제 바이오폴리머

천연소재의 이용 천연소재 식품 의약품 화장품 식물∙동물∙해조류∙기타 기타 건강기능성 식품 (Functional Foods) 신약개발: 선도 화합물 (Lead Compounds) 의약품 천연소재 화장품 기능성 화장품 (Functional Cosmetics) 식물∙동물∙해조류∙기타 신소재: 우주, 자동차, 의류 등 기타

천연소재의 Advance Biotechnology 천연소재의 신소재화 연구개발기술

천연물소재 연구개발의 경제성과 성장 가치 부가가치 향상 생약초, 건약초, 규격약초 가격상승 추출물 ThemeGallery is a Design Digital Content & Contents mall developed by Guild Design Inc. 가격상승 Add Your Text 천연약품 Add Your Text 건강보조식품 Add Your Text 규격추출물 Add Your Text 추출물 Add Your Text 생약초, 건약초, 규격약초

천연물소재에서 생리활성물질을 분리해야 하는 이유 천연물 기원 의약품의 사용역사는 오래지만, 치료 또는 실험적 근거 측면에서 보면, 전초/조추출물 이용시 다음과 같은 결점을 가짐 ADD TEXT 활성성분 함량차이 Side effect 재현성 01 02 03 지리학적-계절적 기후와 생태학적 동식물 부위와 형태에 따라 돌발 생리활성 상승 화합물 생리활성 억제 화합물 길항작용의 불필요 화합물의 공존 채집, 저장 및 조추출물 얻는 과정의 다양성 때문에 생리활성이 감소

생리활성을 지닌 천연물을 분리하는 장점 재현성 순수물질 분석법 확립 대량생산 기작규명 순수한 생리활성 물질들은 치료 또는 실험적 관점에서 재현성있게 정확한 용량으로서 투여가능 인간이나 동물에게 이용될 때 식품의 잠재 독성과 우수성에 대한 동식물들의 검색에 이용됨 분석법 확립 생리활성물질의 구조를 결정함으로서 합성물질의 대량 생산 가능 대량생산 구조-활성 상관관계 확립으로 기작규명으로 더 이상 생리활성 물질원으로서 동식물재료에 의존할 필요 없음 기작규명

천연소재의 일반 분석 1차 대사 산물 인조산물 2차 대사 산물 전처리 단계 채집 추출 분리 추출 액체분배법 (상분리) Stass Otto법 납염 침전법 배양액성분의 분리 Chromatography 단백질 (아미노산) 지방 (지방산) 탄수화물 (당) 무기질 비타민 추출, 분리, 정제 과정시 화합물에 화학적 변화가 일어나서 생성되는 천연물 Ex) 가수분해, Transesterification, Adduct, 인조 합성물

처리 (Dryness, grind, cutting) Preparation of Materials 채 집 생태, 활성에 관한 사전 지식 재료의 정확한 감정 : 학명 타 시료의 혼입 주의 표본(Type)의 보관 처리 (Dryness, grind, cutting) 건조 : 시료의 안정성, 추출용매 선택에 영향, 추출효율, 추출, 농축 시 용이성 추출용매, 추출조건 결정 : 화합물의 안정성

전통적 추출법(Extraction) Petroleum ether: 지방, 납, 정유, 수지, sterol류, essential oil, chlorophyll, 배당체, 일부 alkaloid류 Ether / CHCl3: alkaloid류, 배당체, 색소, tannin, essential oil, 수지 등 Alcohol 온침: 대부분의 비극성물질, 유기산, 염, 당, saponin 등 냉수로 추출: alcohol추출물과 유사, inulin, 수용성유기염 등 열탕으로 추출: 전분, 점액, xylan, pectin 등 10% 염산: alkaloid류, 물에 잘 녹지 않는 염기성 물질 5% NaOH로 온침: 단백질, hemicellulose, pectosan 등 묽은 유황으로 온침: oxycellulose 잔유물: cellulose, lignin 등

전통적 추출법(Extraction) 특정성분 침출법 추출종말점의 결정 적당한 용매로 재료를 침출 직접 분리하고자 하는 화합물을 함유하는 추출물을 조제 측정의 용액으로 추출한 추출물에는 반드시 다량의 성분을 함유할 수 있으므로 다시 분리를 한다. 추출 전 또는 후에 탈지, 탈색, 탈tannin, 탈단백, 발효에 의한 당의 소거 등의 처리를 행한다. 추출종말점의 결정 추출액의 일부를 증발시켜도 잔유물이 없거나 시약에 대한 반응이 나타나지 않거(시약 무반응)나 색으로 판단한다. 소량의 용매로 여러 번 추출하는 것이 효율이 좋다.

Alcohol에 의한 추출(MeOH & EtOH) 식물의 부위와 수분 함량, 목적 물질을 따라 결정 비극성물질과 극성물질을 함께 함유 연구초기 특정 계통의 물질을 결정하지 않을 경우 (bioactivity guided fractionation) 용해능이 크고 경제적이며, 추출, 농축조작이 쉽다 신선한 식물 재료를 추출할 때 일반적으로 우선 효소에 의해 식물 성분이 산화 또는 가수분해되는 것을 방지하기 위하여 식물 조직을 파괴할 필요가 있다. 꽃과 잎의 경우 여러 번 온침 해야 하는데 횟수는 식물에서 알코올로 용출하여 나오는 색 (잎에 있어서는 chlorophyll) 의 농도로 결정한다

추출액의 처리 여과, 원심분리, 침전방치 후 여과, 증발농축, 침전형성, 동결건조, 감압농축 등을 행한다 가능한 저온에서 감압하여 용매를 제거 (in vacuo) : rotary evaporator 이용 Alcohol류, 물을 함유하는 용매, 신선한 시료, 반건조 시료 : 거품이 많이 형성 Monoterpene 등 저비점물질, 승화성물질 : 농축시 휘산하기 때문에 물질에 성질에 따른 농축법이 요구

분획 (partition) Extract (추출물) 내에 존재하는 다양한 물질을 분리 유사 극성 (polarity)을 가지는 화합물 군으로 분획 비극성으로부터 극성 순서 지용성이 높은 화합물, 수용성이 높은 화합물 서로 섞이지 않는 두 용매 (immiscible)를 사용 어떤 물질을 한 상 (phase)에서 다른 상으로 옮기는 것이며 가장 보편적인 경우는 수용액에서 유기용매로의 추출이다. 용액 속에 고체가 현탁되어 있는 경우 여과하여 분리한다 용액에 대하여 녹는 물질과 녹지 않는 물질로 나눈다 물에 녹는 물질은 용매의 극성에 따라 분배한다

분리과정 중 유의해야 할 사항 각 성분들의 구조를 빠른 시간 내에 결정할 수 있도록 아주 순수하게 분리하여야 한다. 성분들의 함량을 정성적으로 파악할 수 있는 예비지식 제공하여야 한다 분리과정 중에서 원래의 성분변화의 최소화  각 성분의 안정성을 고려한 분리방법 선택 열에 불안정한 시료는 감압 하에 처리 chromatography과정 중에 상호화학반응으로 분해될 수 있으므로 자주 TLC 확인하여야 한다. 원래의 화합물로 쉽게 변화시킬 수 없다면 유도체로서 분리하지 않는 것이 바람직하다

분리방법 I 진출 (shaking out) 용액 A와 이것과 섞이지 않는 용액 B를 가하여 흔들고 A로부터 B에 가용성의 물질을 침출하는 과정을 말한다 이 경우 다량의 B를 1회 사용하는 것보다 소량씩 수회에 나누어 흔들어서 추출하는 것이 효과적이다. 용질 (분산매)이 서로 섞이지 않는 두 종류의 용매(상)에 용해할 때를 분배라고 하며 두 용매(상)에서 용질의 농도가 평형에 도달할 때의 농도비를 분배계수(분배율)라고 한다.

분배계수 (partition coefficient), K 큰 부피로 단일 추출에 비해 작은 부피로 여러 번 하는 것이 효율이 더 크다. 용질 A는 toluene과 물 사이에 분배계수 3을 가진다. 0.01M의 수용액 100mL가 toluene으로 추출된다고 가정하자. 500mL로 1회 추출하였을 때 남아있는 A의 분율은 얼마이며 100mL로 5회 추출하였을 때 남아있는 A의 분율은 얼마인가

분리방법 II 용액에 대한 용해도 차를 이용한 분리법 Extract를 적당한 용매 (또는 혼탁용매)와 가열하고, 냉각여과하여 불용부 (침전)와 가용부(여액)로 분리하고 각각을 다른 용매로 처리하여 불용부와 가용부로 연속적으로 분리한다. 또 각 분획물에도 여러가지 성분이 섞여있고 동일한 성분이 이쪽 저쪽에 나오게 되므로 각 분획물에 있어서도 다음의 chromatography와 재결정법 등으로 분리와 정제를 행할 필요가 있다.

분리방법 II 해리성을 이용한 분리법 중성, 산성, 염기성 등의 물질을 분리하는 경우에는 수층의 pH를 변화시켜 유기용매로 침출한다. 염기를 물로 추출하기 위해서는 B가 BH+가 되도록 pH를 충분히 낮추어야 한다. 산 HA를 물로 추출하기 위해서는 산이 A-가 되도록 pH를 충분히 높여주어야 한다.

분리방법 III 염석 (salting out) 납염법 (lead salt method) 효소 분리시 많이 사용 물에 녹더라도 무기염류의 수용액에는 녹기 어려운 유기화합물이 상당히 많다. 이 성질을 이용하여 수용액에 무기염류 (NaCl, KCl, NH4Cl, Na2SO4, (NH4)2SO4, MgSO4, K2CO3 등)을 가하여 결정을 만들거나, 분배되기 쉽도록 한 방법을 염석이라고 한다. 납염법 (lead salt method) 예비시험에서 납염을 침전하는 경우에 이용되어지는 분리법 시액 Pb(OAc)2의 10% 수용액을 사용하거나 2-3% alcohol용액 염기성초산납 (차초산납) Pb(OAc)2Pb(OH)2의 수용액

분리방법 IV 금속 킬레이트제에 의한 추출 유기용매로 추출될 수 있는 대부분의 착물은 중성이어야 한다. Fe(EDTA) 혹은 Fe(1,10-phenanthroline)32+와 같이 전하를 띤 착물은 유기용매에서 잘 녹지 않는다. 금속 이온들을 서로 분리하려면 한 이온이 어느 유기 리간드와 선택적으로 착물을 형성한 후 유기용매에 추출될 수 있어야 한다. 이러한 리간드 각각은 여러 다른 금속이온들과 반응할 수 있으나 pH를 조절하면 어느 정도 선택성을 기대할 수 있다.

정제 (purification I): 수증기 증류 (steam distillation) Essential oil 추출의 경우 비교적 휘발성이 낮은 화합물을 수증기와 함께 증류시켜 정제하는 과정 화합물의 증기압과 수증기압의 합이 1기압에 도달하면 수증기와 함께 유출되므로 증류온도는 100ºC (1기압)을 넘지 않도록 한다. 방향족 화합물, 고급알코올, 정유 성분의 분리에 가장 많이 이용되며, 서로 극성차가 큰 화합물들은 쉽게 분리할 수 있다. 어떤 화합물의 100ºC 부근에 있어서의 증기압과 그 온도의 수증기압의 합이 760 mm이 넘으면 화합물과 수증기의 혼합증기로 되어 유출한다.

정제 II 탈색 (decoloration) 승화 (sublimation) 산화와 환원에 따른 탈색은 목적성분을 변화시킬 위험성이 크다. Chromatography :착색물질을 활성탄 (charcoal), alumina, silica gel 등에 흡착 납염법 Ion exchange :식물체는 chlorophyll, 해양식물의 경우는 fucoxanthine류 승화 (sublimation) 유지, 탄수화물, 염류를 제외한 대다수의 유기화합물은 상압, 감압하에서 승화한다. 혼합물을 승화기구에 넣고 외부에 열을 가하면 상온 상압하에서 비교적 높은 증기압을 가지는 물질은 곧 찬공기와 만나서 결정화되므로 쉽게 분리할수 있다. Quinone류, 산 무수물, ketone, carboxlate, amino acid 등도 승화하기 쉽다. 일반적으로 상압하에서보다 감압하에서 행한다. 승화에 의한 정제는 재결정법과 같이 모액중에 남아있거나 탈색에 사용한 활성탄의 흡착과 같은 손실은 적다.

정제 III 재결정 (rechrystallization) 고체물질을 최종적으로 정제하는 것이 가장 유력한 방법 저온에서 용질의 용해도를 낮추면 결정화가 일어난다. 천연물에서는 결정 모액의 검사도 필요하다, 다른 성분이 함께 결정으로 석출되는 경우는 재결정법으로는 분리할 수 없다. 일반적으로 acetone, CHCl3, CH2Cl2, EtOAc, ether, ethanol,등을 사용하고 특히 융점이 낮은 화합물들의 경우 CH2Cl2와 ether를 많이 사용한다.

천연물화학 분야의 중요한 발견