면역혈청분과 외부신빙도조사 현황 대한임상검사정도관리협회 면역혈청분과위원회장 차 영 주

TOPIC 1. History 2. 정도관리 현황 3. 검사방법 별 분석 자료 Analytical vs Clinical Mutant Detection 4. 향후 발전방향 면역혈청분과

1976 년 대한임상검사정도관리협회 외부신빙도조사 시작 1982 년 HBsAg 과 매독혈청검사 (serologic tests for syphilis: STS) 와 같이 수혈관련 검사항목에 대한 외부 신빙도조사 시작 History

면역혈청분과 가입기관의 변화 1982 년 : 72 기관 2007 년 : > 600 기관 >99% 1986 년 1993 년 1997 년 1999 년 2001 년 2003 년 2005 년 2006 년

면역혈청분과 가입기관 분포 종합병원 병 / 의원 대학병원 보건소 병 / 의원의 가입이 증가 보건소의 가입이 극히 저조

HBsAg 2STS 3ASO 4Widal 5CRP 6RF 7Anti-HBs 8Anti-HIV 9Anti-HCV 10Anti-HBc 면역혈청분과 조사항목의 변화

HBsAg 검사방법의 변화 CIA MEIA Rapid 2006 년

Anti-HBs 검사방법의 변화 CIA MEIA Rapid 2006 년

Methods for HBsAg Commonly Used in Korea (2006) MEIA CIA Rapid From the Survey of Korean External Quality Assurance (2006) EIA FEIA 131 ECIA 24% N=495 (51%) 110

1. Analytical Sensitivity with WHO Standard 2. Clinical Sensitivity Using Seroconversion Panel Sensitivity Evaluation of HBsAg Immunoassays

WHO STANDARD (IU/ml) Architect ElecsysCentaurMurex Dade- Behring Green Cross 3.3PPPPPP 0.33PPPPPP 0.2PPPPPP 0.1PPPPNN 0.075PPPPNN 0.05PNPPNN 0.025NNNNNN NNNNNN Sensitivity of HBsAg Assays Using WHO Standard (adw2) CIA (ECL) ELISA

1. Analytical Sensitivity with WHO Standard 2. Clinical Sensitivity Using Seroconversion Panel BBI Seroconversion panel (PHM935B) BBI Seroconversion panel (PHM915M) BBI Seroconversion panel (Donor No.63701) ZeptoMetrix HBV11000 (Acute Stage) BBI Seroconversion panel (Donor No.62433) (Acute to Recovered Disease Hepatitis) Sensitivity Evaluation of HBsAg Immunoassays

BBI PHM935B (Bleed days)/HBV DNA Architect ElecsysCentaur Murex Dade- Behring Green Cross 01 (128) / 4  10 3 PPPPPP 02 (135) / 1  10 3 PPPPPP 03 (151) / 5  10 2 PPPPPP 04 (165) / 8  10 2 PPPPPP 05 (175) / 2  10 3 PPPPPP 06 (189) / 8  10 2 PPPPPP 07 (203) / BLD * PPPPPP 08 (217) / BLD * PPPPPP 09 (231) / BLD * PPPPPN 10 (246) / BLD * PNNPNN 11 (262) / BLD * NNNNNN 12 (273) / BLD * NNNNNN * BLD: Below limit of detection Sensitivity of HBsAg Assays Using Seroconversion Panel

(ECL) (CIA) (MEIA)

Sensitivity of HBsAg Assays Using Seroconversion Panel (ECL) (CIA) (MEIA)

ZeptoMetrix HBV11000 ArchitectElecsysCentaurMurex Dade- Behring Green Cross (10/30/97) NNNNNN (11/02/97) NNNNNN (11/11/97) NNNNNN (11/13/97) NNNNNN (11/18/97) PNNPNN (11/20/97) PNNPNN (11/25/97) PPPPPP (11/28/97) PPPPPP (12/02/97) PPPPPP Sensitivity of HBsAg Assays Using Seroconversion Panel for Acute Stage Hepatitis B

Sensitivity of HBsAg Assays Using Acute to Recovered Disease Hepatitis Seroconversion Panel (ECL)(CIA)(MEIA)

HBsAgAnti-HBsAnti-HBcAnti-HCVAnti-HIV 양성 1차1차 차2차 음성 1차1차 차2차 바이러스 항원 및 항체 외부신빙도조사 결과 (2005) 4/7 기관 (Rapid)57/64 기관 (Rapid) 4 기관 (Rapid)7/8 기관 (Rapid)

HBsAgAnti-HBsAnti-HBcAnti-HCVAnti-HIV 양성 1차1차 차2차 음성 1차1차 차2차 바이러스 항원 및 항체 외부신빙도조사 결과 (2006) 8/11 기관 (Rapid) 12 기관 (Rapid) 9/11 기관 (Rapid)

Rapid Assay RPHA/PHA 를 대치 문헌 상에는 ICA 예민도 가 RPHA 보다 우수 (Sato 등, J Clin Microbiol, 1996) – Dainascreen HBsAg 3.1 ng/mL – Dainascreen Ausab 42 mIU/mL RPHA 에서도 양성인 검체에 대하여 ICA 로 음성을 보고한 기관이 소수 있슴 HBsAg/Anti-HBs 검사에서의 Immunochromatography (ICA)

HBsAg 검사에서 ICA (Rapid) 국내제품 평가 ICA 1 (SD) ICA 2 ( 녹십자 ) ICA 3 ( 아산 ) RPHA ( 아산 ) MEIA 음성 (N=20) S/N < 2.0 S/N  /20 Neg 20/13 Pos 20/16 Pos 20/17 Pos 20/13 Pos 국산 ICA 제품의 HBsAg 검사 : S/N  60~130 이어야 양성 MEIA 양성 (N=20)

Anti-HBs 검사에서 ICA (Rapid) 국내제품 평가 ICA 1 (SD) ICA 2 ( 녹십자 ) ICA 3 ( 아산 ) PHA ( 아산 ) < 10 mIU/mL  10 mIU/mL 20/20 Neg 20/19 Neg 20/20 Neg 20/17 Pos 20/19 Pos 20/18 Pos 국산 ICA 제품의 Anti-HBs 검사 :  15 mIU/mL 인 경우에는 항상 양성 MEIA 음성 (N=20) MEIA 양성 (N=20)

Anti-HCV 검사방법의 변화 CIA Rapid MEIA EIA 1986 년 1993 년 1997 년 1999 년 2001 년 2003 년 2005 년 2006 년

Anti-HIV 검사방법의 변화 CIA MEIA Rapid EIA 2006 년

대한임상검사정도관리협회 외부신빙도조사 결과 (2005) : Anti-HCV 제 1 차 (A 검체 ) 제 2 차 (A 검체 ) 제조회사 음성양성총계 음성양성총계 에스디 3214 (8)46 32 (2)32 녹십자 34 (2)7 66 아산 Bio Focus Human 3 3 Diakey 1 1 Biosystems 1 (1)1 기타 91(1)10 14 (1)5 총 계총 계 5719 (11) (4)49 Immunochromatography (ICA)

Anti-HCV 검사에서 Immunochromatography (ICA), Rapid assay 제조회사 별 신빙도조사 결과 (2005) 음 성음 성 Gray zone 양 성양 성총 계총 계 에스디 녹십자 3227 아산 6 6 Bio Focus3 3 Human3 3 Diakey1 1 기 타기 타

대한임상검사정도관리협회 외부신빙도조사 결과 (2006) : Anti-HCV 제 1 차 (A 검체 ) 제 2 차 (A 검체 ) 제조회사 음성양성총계 음성양성총계 에스디 249 (13)51 녹십자 167 아산 Bio Focus 2 3 (1) 5 LG 1 2 (2) 3 Diagnostic Biotechnology 1 1 Biosystems 기타 6 (2)6 총 계총 계 1170 (18)81 Immunochromatography (ICA)

Anti-HCV 검사에서 Immunochromatography (ICA), Rapid assay 제조회사 별 신빙도조사 결과 (2006) 음 성음 성 Gray zone 양 성양 성총 계총 계 에스디 녹십자 167 아산 Bio Focus LG1 2 3 Diano-Bio1 1 기 타기 타

1. 검사 키트 국내에서 사용되는 ICA 검사 키트의 예민도 및 특이도 제품에 따라 Lot 별로 결과 차이 발생 2. 검사시 판독시간 및 기준 3. 시약의 변질이나 보관 상태 습기차단, 밀봉여부가 결과에 영향 시약 개봉 후의 유효기간 설정 필요성 시간이 지날수록 대조선 및 검량선 색깔 미약 ICA, Rapid Assay 검사 주의사항

Rapid Assay (SD ICA) 와 CIA 비교 (2007) Anti-HCV : Positive by CIA (<10.0) RapidCIA N2.53Accurun 1 N1.49Patient 1 N2.10 Patient 2 N2.37 Patient 3 N8.12 Patient 4 N8.97 Patient 5

Anti-HCV Positive > 11.0 Pooled seraPatient 1Patient 2 RapidCIARapidCIARapidCIA X 2P9.24P P>11.0 X 4P4.64P P>11.0 X 8P2.48P P>11.0 X 16P1.53P P>11.0 X 32P0.83P P>11.0 X 64N0.56P P>11.0 X 128N0.45P P8.96 X 256N0.21P P4.55 X 512N0.12P P2.53 X,1024N0.11P1.45P1.51 X 2,048 P0.98P0.97 X 4,096 P0.41P0.75 X 8,192 P0.17P0.18 X 16,384 N0.11WP0.11 X 32,768 N0.11N<0.02 X 65,536 N<0.02N

Anti-HIV 검사의 목표 1. To detect HIV1 and HIV2 antibodies 2. To detect HIV1 groups ( i.e. Group O ) 3. To decrease serological window

Anti-HIV PA 제품 Using gelatin particles coated with recombinant HIV-1 antigens (HIV-1/gp41 and HIV-1/p24) and HIV-2 antigen (HIV-2/gp36).

Anti-HIV 양성검체 이중용기 CRP, RF, ASO 정량검사용 상품화 관리물질 냉장택배 인터넷 입력 2000 년 이후의 주요 변화 HBsAg Mutant >99% 참여율

How Prevalent Is the HBsAg in Korea? The prevalence of HBsAg was 5.1% in Men and 4.1% in Women Based on the 1998 National Health and Nutrition Survey Three times more prevalent in Jeju Island in both sexes Lee et al. (2002) J Korean Med Sci 17:457  62

Mutations in Surface Gene Naturally Occurring Prolonged Exposure to High Level of Anti-HBs

How Prevalent Are the HBsAg Mutants? 1. Vaccinated Group 2. Chronic Carriers/Hepatitis 3. General Population/Blood Donors

Vaccine Escape Mutant in Newborn First reported in Italy by Carman (1990) Followed by reports by Harrison from Singapore, and Fujii and Okamoto from Japan (1992) C T K P T D G N 145 C 141 R C C A P T/I C HBsAg mutants cluster near aa In Vaccinated Group Prolonged Exposure to High Level of Anti-HBs

In Chronic Carriers/Hepatitis Prevalence of Naturally Occurring Surface Antigen Variants of HBV in Korean Patients Infected Chronically Song et al. (2005) J Med Virol 76:194~202

~147 (37) ‘a’ determinant Amino Acid Mutation Patterns in the MHR of HBsAg in Korean Patients HBV Song et al. (2005) J Med Virol 76:194~202 1st Loop 124~137 (31) 2nd Loop 139~147 (6) 59 mutations found in 47 patients

HBsAg Reactive (365.7) Anti-HBsAnti-HBcClinical Dx Pt 1 2 Reactive (385.3) Non- Reactive (13.2) Non- Reactive Chronic Hepatitis 3 Reactive (247.3) Reactive (148.6) Reactive Diarrhea & Gastroenteritis Chronic Hepatitis Chronic Gastritis Essential HT Renal Calculus I126S No mutation Q54R, L98V, Q101R Detection of HBsAg Mutants in Patients’ Sera

Donors born from carrier mothers Not detected by certain assays S Gene Mutations in Blood Donors – G145A + T126N – G145R + P120Q HBsAg Mutants Recently Found in Korean Blood Donors

Detection of HBsAg Mutant (2004) 검체 : Recombinant G145R Serum – Provided by Abbott Lab (USA) 결과 : 39% 양성 보고 (58/147 기관 ) 7 종류의 검사 키트가 HBsAg Mutant 검출 가능

Detection of Recombinant G145R HBsAg Mutant Provided by Abbott (2004) Axsym BEP Cobas Core Immulite Vidas Elecsys PosGreyNegTotal IMx Architect Microplate ELISA 0047

HBsAg Mutants ? aa 129, 131, 133, 134 R ecombi- nant Ag ArchitectElecsysCentaurMurex Dade- Behring Green Cross Q129HPPPPPP T131IPP T131PPP M133LPPPPPP Y134SPP

HBsAg Mutants ? aa 141  144 Recombinant Antigen ArchitectElecsysCentaurELISA * K141EPP P142LPPP P S143L (ayw)PPNP T143L (adw2)PPN C76Y/T143M/F/N219SPPNP D144G/APPN * ELISA : Dade-Behring, Murex, Green Cross

HBsAg Mutants ? aa 145 Recombinant AgArchitectElecsysCentaur Bio- Rad Dade- Behring G145RPNNPP G145R/T126SPN G145R/P142LPNN G145R/P142SP N G145R/D144APN

HBsAg Mutants ? Native Sera ArchitectElecsysBio-Rad Dade- Behring G145R/P120Q*PPPN G145A/T126N*PP P G145R/F134RP M125T/T127P/ P142A/G145R P G102S/T126T/I/ G145R/E164G P M134T/D144G/V191A/ S211R PP S143LPP S143L/Y206G/S207RPP

Mutation Recombinant Antigen* Pos ≥ 1 COI Native Serum (neat) Pos ≥ 1 COI G145R / F134R (subtype adr) negative17.16 M125T / T127P / P142A / G145R (subtype ayw) negative1.46 Elecsys HBsAg detects HBsAg mutants in native serum due to high sensitivity for the wild-type virus Detection of HBsAg Mutants Native vs Recombinant

1. HBsAg immunoassays kit 마다 예민도 차이  Low Level Viremia 도 의미 ① Early Phase Infections ② Low Level Carriers ③ S Gene Mutations 2. HBsAg mutants 검출도 차이 What are the Problems in HBsAg Detection?

In Occult HBV Infection Prevalence of Naturally Occurring Surface Antigen Variants of HBV in Nonimmunized HBsAg(-) Chinese Carriers Hou et al. (2001) hepatology 34:1027~34

~147 (37) ‘a’ determinant Amino Acid Mutation Patterns in the MHR of HBsAg in HBsAg(-) Chinese Carriers HBV 1st Loop 124~138 (15) 2nd Loop 139~147 (11) 32 mutations found in 16 patients Hou et al. (2001) hepatology 34:1027~34

Prevalence of Low Level HBsAg in Korea Cha & Chae (2004) Korean J Blood Transfusion 23 /695 (3.1%) HBsAg concentration, S/N < 10.0 (< 2 ng/mL) by using the AxSYM MEIA system Among 695 HBsAg (+) Patients In Chung-Ang University Hospital From Jan 2003 to Apr 2004 HBV

면역혈청분과 EQA 향후 발전 방향 (1) 1. 환자의 혈청 − Pooled or Single − 제조방법의 표준화 − 감염의 우려 − 환자 기증 동의서 2. 상품화된 관리물질 − 비용 증가 정도관리물질의 확보

면역혈청분과 EQA 향후 발전 방향 (2) 냉장택배 : 용마로지스 정도관리물질 운송

정도관리물질 운송시스템의 현대화 Insulated Temperature-Controlled Shipping System − +2.0  +8.0°C, -20°C, +22  +24°C − 비용 증가 − 여러 분과가 합동으로 물질 발송 − 면역혈청분과 & Immunoassay 분과

-18°C (  3°C) for 48 hrs +5°C (  3°C) for 24 hrs Specimen Insulated Temperature-Controlled Shipping System

1 day 2 day3 day

면역혈청분과 EQA 향후 발전 방향 (3) 1. 시약 및 기기 분류 2. 검사방법 3. 결과 표기 4. 적절한 통계방법 시약, 기기 및 검사방법의 평가

EQA 를 통한 진단시약의 시판 후 평가  검증 1. 진단시약 생산의 지속적인 모니터링 − Lot to lot variation 2. 개발 당시 예측하지 못하였던 문제점 발견 3. 검사방법의 변화  발전 4. 허가 받지 않은 시약의 사용

DNA Chip (38%) Hybrid Capture (36%) PCR-RFMP (6%) HPV 검사의 이용 현황 (2 차  3 차 의료기관 ) PCR (18%) Sequencing (1%)

DNA Chip (44%) Hybrid Capture (7%) PCR-RFMP (8%) HPV 검사의 이용 현황 ( 산부인과 개원의 ) PCR (39%) Sequencing (1%)

Hybrid Capture (55%) 대한임상검사정도관리협회 외부신빙도조사 참여 현황 (2005) : HPV DNA PCR (16%) 기타 (13%) Hybridization (10%) DNA Chip (6%)

더욱 철저한 정도관 리 요구 − 인증받은 검사실에서 만 사용하도록 판매시에는 반드시 식약청 허가 요구 더욱 철저한 정도관 리 요구 − 인증받은 검사실에 서만 사용하도록 Homebrew PCR, Research Use Only Homebrew PCRResearch Use Only

CONCLUSION: EQA Contribution 1. Clinical Practice Expectations 2. Medical Laboratories Expectations ① Participant Performance Evaluation ② Method Performance Evaluation ③ Continuous education, training & help 3. Industry Expectation: IVD’s vigilance 4. Public Health Expectations 5. Legal Medicine Expectations 6. Patient Safety Expectation