The Determination of Methylxanthines in Chocolate and Cocoa by Different Separation Techniques : HPLC, Instrumental TLC, and MECC 2007051004 유혜선 2007051046 조혜란 Vol. 86 No. 11 November 2009, Journal of Chemical Education

발표 순서 1. Introduction 2. Background 3. Experiment 4. Result & Discussion 5. Conclusion 6. Hazards 7. Literature Cited

1. Introduction Chocolate과 cocoa에는 methylxanthines가 들어 있다. Methylxanthine이란 xanthine의 수소 자리에 methyl기가 붙어 있는 물질이다. Methylxanthine에 해당하는 물질은 여러 가지가 있지만 chocolate과 cocoa에 함유된 methylxanthine에는 caffeine, theobromine, theophylline이 있다.

2. Background Solid-Phase Extraction(SPE):고체상 추출이란 소량 부피의 크로마토그래피 정지상을 사용하거나 분자 단위로 각인된 고분자를 사용하여 시료로부터 matrix를 제거하고 원하는 분석물질을 분리하는 방법이다. High-Performance Liquid Chromatography(HPLC): 고성능 액체 크로마토그래피란 미세한 입자들로 충전된 막힌 칼럼을 통해 높은 압력으로 용매를 흘려주어 물질을 분리하는 방법이다.

Thin-Layer Chromatography(TLC):얇은 막 크로마토그래피란 유리판 등에 실리카 흡착제의 얇은 막을 입혀 고정상으로 하고, 유기용매를 이동상으로 하여 시료 내 혼합물질을 각각의 단일물질로 분리하는 방법이다. 분리된 시료의 이동한 거리를 Rf값으로 판정한다.

Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography(MECC): 마이셀 동전기 모세관 크로마토그래피란 마이셀이 유사 정지상처럼 거동하는 것으로 음이온 계면활성제 sodium dodecyl sulfate(SDS) 가 임계 마이셀 농도 이상으로 존재하여 음으로 하전된 마이셀을 형성한 후 중성 분자와 이온을 분리하는 방법이다.

기울기 용리 : 크로마토그래피에서 용매의 성분 조성을 계속적으로 변화시켜 용매의 용리 세기를 점점 증가시키는 방법이다. 전개율(Rf)=

3. Experiment SPE of Methylxanthines from Chocolate and Cocoa ① 잘게 부순 Chocolate과 Cocoa powder를 각각 500mg씩 준비하여 20mL 증류수에 녹인다. ② 용액을 sealed tube에 주입한 후 tube를 항온조에 넣어 80°C에서 15분간 가열한다. ③ 진공에 가까운 상태(5 mmHg)에서 SPE tube의 조건을 잡아준다. 유기물질을 제거하기 위해 1mL의 methanol로 tube를 씻어낸 후 잔여 methanol을 1mL의 증류수로 씻어준다.

④ 0.5mL의 시료를 column에 주입한다. ⑤ 극성 물질( matrix)을 제거하기 위해 1mL의 증류수로 column을 씻어준다. ⑥ 2.5mL의 methanol로 2번에 걸쳐 용리한다. ⑦ 2개의 시약병을 40°C에서 질소 기체를 통하여 건조하고 농축시킨 후 1000μL의 증류수에 녹인다.

⑧ 용액을 200μL씩 5 aliquots으로 나누어 그 중 3 aliquots을 각각 HPLC, MECC, I-TLC 분석에 사용한다. ⑨ 3가지 분석 방법에 적합한 다양한 조성의 용리액을 준비하고 시료를 각 분석 방법에 적합한 상태로 준비한다. ⑩ 3가지 분석 방법에 적합한 형태로 caffeine, theobromine, theophylline의 표준 용액을 1×10-5~5×10-4M로 준비한다.

Optimization of the Seperation by HPLC of the Mixed-Methylxanthines Standards and Samples ① HPLC column에 시료와 용리액을 주입한다. 용리액은 methanol과 물을 혼합하여 사용한다. 다양한 조성의 용리액으로 실험하여 용리액의 세기를 변화시키며 최적의 조건을 찾는다. ② Methylxanthines 표준 용액을 낮은 농도에서 높은 농도로 바꾸어가며 HPLC column에 주입한다. 각각의 methylxantines에 대하여 농도를 x축, UV 272nm의 파장에서의 적분값을 y축으로 하여 Calibration Curve를 그린다.

Optimization of the Seperation by MECC of the Three Methylxanthines Standards and Samples ① 0.3psi로 2초 동안 압력을 가하여 buffer electrolyte를 주입한 후 5분간 모세관의 최적 조건을 조성한다. ② 20kV의 전압을 걸어준 후 시료를 주입한다. ③ Phosphate buffer 20mM(pH 8)과 SDS 10mM을 넣어준 후 완전한 분리를 위해 SDS 농도를 점점 증가시켜준다.

④ Methylxanthines 표준 용액을 낮은 농도에서 높은 농도로 바꾸어가며 MECC 모세관에 주입한다 ④ Methylxanthines 표준 용액을 낮은 농도에서 높은 농도로 바꾸어가며 MECC 모세관에 주입한다. 각각의 methylxantines에 대하여 농도를 x축, UV 280nm의 파장에서의 적분값을 y축으로 하여 Calibration Curve를 그린다.

Optimization of the Separation by TLC of the Three Methylxanthines Standards and Samples ① twin trough chamber에 methanol과 ethyl acetate를 혼합한 용매 15mL와 30% NH3 수용액을 넣어준 후 평형을 이루게 한다. ② 20cm×10cm TLC판에 시료와 Methylxanthines 표준 용액을 spotting한 후 twin trough chamber에 넣어 전개시켜 분리한다. ③ methanol과 ethyl acetate의 비율을 바꾸어가며 분리가 가장 잘되는 조건을 찾는다.

④ TLC판을 272nm의 TLC Scanner3에서 scan한다. 각각의 spot에 대한 적분값 data가 CATS 4 ④ TLC판을 272nm의 TLC Scanner3에서 scan한다. 각각의 spot에 대한 적분값 data가 CATS 4.06 program에 의해 인식되어 농도를 구할 수 있다.

4. Result & Discussion HPLC - Methanol과 증류수의 비율이 30 vol% : 70 vol %일 때 가장 분리가 잘 되었다.

MECC

I-TLC - Ethyl acetate, methanol, ammonia의 비율이 90 vol% : 10 vol% : 8.9 vol%일 때 분리가 가장 잘 되었다.

5. Conclusion 구조적으로 유사한 caffeine, theobromine, theophylline을 HPLC, MECC, I-TLC 등 여러 방법을 이용하여 확실하게 분리하고 정량 분석을 할 수 있다. 이 실험은 2일 이상이 소요되며, 학생들은 분리 분석에 필요한 technique들을 익힐 수 있다. 분석 방법은 달라도 chocolate과 cocoa에 함유된 methylxanthine의 농도는 거의 같은 수치가 얻어졌음을 알 수 있다.

6. Hazards Methanol은 가연성이며 내복 시 독성을 지니고, 피부와 눈을 자극할 수 있다. Ethyl acetate는 가연성이며 피부와 눈, 호흡계를 자극할 수 있다. SDS는 흡입 시 해로우며, 피부와 눈, 호흡계를 자극할 수 있다. Ammonia는 부식성이므로 주의해야 한다. 시약을 다룰 때 장갑과 보안경을 착용해야 한다.

7. Literature Cited

Thank You! - The end -