Method validation

규제기관에서 분석 방법에 원하는 사항 Method validation 원료 의약품과 완제의약품의 물질적 묘사와 특징화 -화학구조규명 In process control Reference standard의 특징화 Spec. – 분석방법의 묘사 저장을 위한 컨테이너나 밀봉시스템의 평가 완제의약품과 원료의약품의 안정성 완제의약품 개발의 Justification 불활성의 구성분의 간단한 분석방법에 대한 references 생물학적 동등성 의약품 개발 보고서

분석방법의 다양한 이용 Analytical Testing Support to Regulatory Filings Clinical Trials Process development /Characterization /Controls Product Development Formulation Packaging Stability/ Release Toxicology/ Pharmacokinetics

의약품 개발 단계 개발기간 -14.9년 - 산업체 평균 Discovery 개발 비용 – 500 million US $ Prephase I Phase I Phase II Phase III Filing/ Approval IRF/NDA

의약품개발단계의 진행 API (Active Pharmaceutical Ingredients)의 발견, 개발 전임상 1상 약리적 독성학적 연구 IND (Investigational New Drug) Application 임상 1상 에서 단순 배합비로 제조 - 건강인 대상 안전성 평가 임상 2상에서 표적이 되는 환자군 대상 임상적 유효성 평가 임상 3상 에서 API 포함한 최종 완제품의 형태로 배합 몇백에서 몇천명에 이르는 double blind test 규제기관에 제출서류 의약품의 이상적, 약동학적, 독성학적, 화학적, 규제적 사항에 대한 총망라  문서화

Method Validation 분석법이 사용목적에 맞게 정확하고 신뢰성이 있는지를 증명하는 문서화 과정 CFR 211.165(e) The accuracy, sensitivity, specificity, and reproducibility of test methods employed by the firm shall be established and documented. Such validation and documentation may be accomplished in accordance with 211.194(a)(2)

USP 25 General information(1225) Validation of an analytical method is the process by which it is established, by laboratory studies, that the performance characteristics of the method meet the requirements for the intended analytical applications ICH Q2A The objective of validation of an analytical procedure is to demonstrate that it is suitable for its intended purpose

Life cycle of an analytical method Development Optimization Pre-Validation Revalidation Validation Implementation 52 8

Method Validation의 필요성 분석의 신뢰성 확보 의약품 허가 시 규제기관에 검증 자료 제출 요청 정확하게 평가된 의약품을 소비자에게 제공

Method Validation 전 요구 사항 1. 문서화된 분석절차(SOP) 2. 장비 – 사용 전 적격성 평가와 보정 3. 실험자 – 안전 및 기기사용법에 대한 적절한 교육 및 평가 받아야 4. 시험 재료 – 분석목적에 맞는 조성과 품질을 만족하는지 평가(순도, 안정성, 보관 취급상의 주의 확인) 5. 표준품 - USP 표준품과 같은 1차 표준품 또는 이들 표준품에 대하여 보정한 자가 표준품 6. 안정성 – validation전에 시험시료와 시약의 안정성 평가하여야 - 시료의 안정성: 동결-해동의 반복을 통해 평가 - 시약의 안정성 : 재생한 stock soln. 과 이의 희석용액으로 평가

분석법 개발 및 validation 절차 1. 분석법 개발 계획 정의 2. 기본 정보 수집(분석 물질, 농도 범위, 샘플 매트릭스 등) 3. 분석법 개발 4. 표준작업 방법서(SOP) 마련 5. 허용기준 설정을 위한 예비 validation 6. Validation protocol 작성 - 목적 - 적용범위 - 책임 - 관련 표준작업서와 참고 문헌 - 사용물질과 기기 - 검증항목별 실험절차 - 통계분석 - 검증 항목 별 허용기준 7. Validation 실험 실시 8. 데이터 분석 9. Validation report 작성

Method Validation 방법 확인 시험 (Identification) 시료중의 분석물질의 동질성을 보증하는 방법 - 검체와 표준품의 특성 비교 순도시험 (Impurity) 시료중의 불순물 또는 분해물을 정량 또는 한도시험 정량시험(Assay) 시료 중의 주요분석 물질 또는 기타 시료 구성성분의 함량이나 역가를 측정하는 시험

Validation Parameters: USP and ICH Specificity Accuracy Precision Method Validation Detection Limit Quantitation Limit Range and Linearity Robustness/Ruggedness System Suitability 14 13

분석형태에 따른 Validation 항목 분석형태/Validation 항목 확인시험 순도시험 정량시험 정량 한도 정확도 - + 반복성 실험간 정밀도 특이성 검출한도 정량한도 직선성 범위 강건성

Method validation 분석방법에 대한 검증 작업 - 정확성 : 참값과 측정값의 정확도를 측정하는 검증 절차 - 정밀성 : 분석법을 이용한 측정치의 반복성 측정 검증 - 특이성 : 복잡한 매트릭스의 시료에서 목적 성분만을 측정하는 능력 검증 - 검출한계 : 검출이 가능한 최저의 시료 농도 검증 - 정량한계 : 정량이 가능한 최저의 시료 농도 검증 - 직선성과 범위 : 일정범위에서 시료 농도의 비례 정도에 따른 결과의 추산 정도 검증 - Ruggedness : 재현성 측정 검증 - Robustness : 변수의 의도적 변화를 통해 결과에 영향을 미치지 않는 정도 검증

정확도(Accuracy) 참값과 실험값간의 근접 정도 평가 - 회수율 (%) = (측정값/이론값) X100 - 신뢰구간 = 평균 ± t (n-1, α/2) n V

정확도(Accuracy) Accuracy for Assay ① Using known purity (e.g. reference material) Spiking experiment (Placebo or Sample에 Spiking ) ② Dilution experiment Accuracy for Impurity ① drug substance or product Spiked known amount Impurity ② No Impurity or degradation product : compare with independent method results ③ Using response factor of drug substance Recommended Data : 3 concentration/3 replicates covering the specified range

정확도의 실험 예 - 참값과 실험값간의 근접 정도 정확도의 실험 예 - 참값과 실험값간의 근접 정도 μ±2σ 이론값(IU) 측정값(IU) 95% 신뢰구간(IU) 측정값 평균(IU) 이론값-측정값 평균 회수율(%) 80 75 62.7~ 109.9 82.3 -2.3 102.9 90 82 100 91 73.2~132.8 103 -3 115 120 11 99.1~138.9 119 1 99.2 127

정밀도(Precision) 규정된 조건하에서 동일하고 균질한 시료를 여러 번 취하여 분석한 측정값 사이의 근접 정도 (산포정도) 1. 반복성(Repeatability) 2. 실험간 정밀도 (Intermediated preciwion) 3. 재현성(Reproducibility) 정밀도의 평가 - 표준 편차, 분산, 상대표준편차 등으로 평가 - 분산 분석법으로 오차에 대한 각 인자의 영향성을 추가로 평가

분산분석을 통해 각 인자에 대한 효과를 적절하게 평가 반복성(Intera-assay precision) - 동일 분석자, 동일 장비, 동일 시약 등의 동일 실험 조건에서 짧은 기간 동안의 시료분석 결과의 정밀도 - 평가 - 분산 v = - 표준편차 = - 상대표준편차(변동계수, CV) = ( /평균) X 100(%) 실험간 정밀도(Within-laboratory precision) - 동일 시료에 대해 같은 실험실 조건에서 날짜간, 실험자간, 장비간 등의 실험실내의 편차를 평가 재현성(inter-laboratory precisoon) - 동일 시료를 사용하여 분석하나 다른 분석자, 다른 장비, 다른 시약, 다른 날짜 등의 변수들이 개입되는 실험실간의 정밀도 분산분석을 통해 각 인자에 대한 효과를 적절하게 평가 V V

반복성(Repeatability) 실험 방법 Using homogeneous, authentic samples ① Minimum of 9 determination(3 conc./ 3 replicates each) covering the specified range ② Minimum of 6 determination at 100% of the test concentration

반복성의 실험 예 - 동일 분석자, 동일 장비, 동일 시약 등의 동일 실험 조건에서 짧은 기간 동안의 시료 분석 결과의 정밀도 반복성의 실험 예 - 동일 분석자, 동일 장비, 동일 시약 등의 동일 실험 조건에서 짧은 기간 동안의 시료 분석 결과의 정밀도 RUN Low(25IU) Mid(50IU) High(75IU) 1 24.4 49.5 76.3 2 25.8 49.2 73.8 3 24.1 48.4 74 4 25.5 47.8 77.6 5 24.7 49.8 75.3 6 26.1 48.1 77.8 평균 25.1 48.8 75.8 표준편차 0.8 1.7 CV(%) 3.2 2.3

변동계수(Coefficient of Variance: CV) 표준 편차의 크고 작음을 짐작 가능 CV(%) = (s / x ) x 100 (s : 자료의 표준편차, x : 자료의 평균)

실험간 정밀도 예 3인자 2수준 랜덤화 STD order Run order 분석자 시약 날짜 결과 2 1 JJE Fluka 21 10 KCS 13 6 5 Sigma 11 4 12 7 22 8 3 14 분석자 시약 날짜 JJE Fluka 21 22 Sigma KCS 3인자 2수준 랜덤화

분산분석 (ANOVA) Source 자유도 SS MSE F p 분석자 1 10.125 4.26 0.108 시약 6.125 0.83 0.184 날짜 0.125 0.05 0.830 오차 4 9.5 2.375 합계 7 25.875

특이성 불순물, 분해물질, 부형제, 매트릭스 등과 같이 시료에 존재한다고 기대되는 성분의 존재하에서 분석물질이 방해를 받지 않고 선별적으로 정확하게 평가될 수 있는 능력  LC에서의 선택성은 최적의 column alc mobile phase, column 온도, detector 파장등 분석 조건의 최적화로 LC에서의 한 피크가 단일 성분인지 복합성분인지 구별의 어려움  UV/Visible diode-array detector, mass spectrometers를 통해 확인 가능

Dilution of a standard stock solution 직선성(Linearity)분석 물질의 농도(독립변수)와 실험결과(종속변수)가 일정한 범위에서 비례하는 정도 평가 방법 – 회귀분석 실험방법 Dilution of a standard stock solution Minimum of 5 concentrations is recommended

직선성 실험의 예 회귀분석 1 차 모델의 적합성 판단 1차 회귀모형 : y = 0.9183x + 5.95 R2 = 0.9885 Dose (IU) Run1 Run2 Run3 10 12 20 15 30 32 38 35 50 48 70 72 67 71 90 89 92 1차 회귀모형 : y = 0.9183x + 5.95 R2 = 0.9885 회귀분석 1 차 모델의 적합성 판단 자유도 SS MSE F p Regression 1 10120 1117.76 0.00 Residual error 13 118 9 Total 14 10238 즉, 귀무가설 기각 (β1 ≠ 0 )  이 식으로 x, y관계설명

Regression plot

회귀분석 진단 : 잔차분석 오차항의 정규성 등분산성 불편성 평가 Dose Response (run 1) Residual Fit 10 12 -3.13 15.1 20 4.87 15 -0.13 30 32 -1.50 33.5 38 4.50 35 1.50 50 48 -3.87 51.9 -1.87 70 72 1.77 70.2 67 -3.23 71 0.77 90 89 0.40 88.6 92 3.40 오차항의 정규성 등분산성 불편성 평가

범위(Range) 적정 수준의 정밀도, 정확도, 직선성을 갖는다고 증명된 상한과 하한 사이의 농도 Range (minimun specified ranges with ICH) Assay of a drug substance(or a finished product) : 80 ~ 120% of test conc. Determination of an Impurity : 50 ~ 120% of the spec. Content uniformity : 70 ~ 130% of test conc. Dissolution Testing : ±20% over the specified range

검출한도(Detection Limit) 검출 중의 불순물 또는 분석물질을 정확한 값으로 정량화 할 필요가 없는 최소의 양 정량한도(Quantitation limit) 적절한 정확도와 정밀도로 검체 중의 불순물 또는 분석물질을 정량적으로 분석할 수 있는 최소의 양 - 평가 방법 1) Visual Evaluation 2) Signal-to-Noise : 3 or 2:1 3) Standard Deviation of the Response and the Slope (QL = 10σ/s, DL = 3.3σ/s (s: 표준 곡선의 기울기))

DL & QL Item Method Example Based on Visual Evaluation DL : The minimun concentration at which the analyte can be reliably detected QL : The minimun concentration at which the analyte can be quantified with acceptable accuracy and precision Electrophoresis Based on Signal-to-Noise Signal(Sample with known low concentration of analyte) : Noise(Blank sample) DL : A Typical signal-to-noise ration is 2:1 or 3:1 QL : A Typical signal-to-noise ration is 10 :1 Validated by suitable number of samples known to be near or prepared at the DL/QL UV Spectrophotometer, LC Based on the Standard Deviation of the response and the Slope DL = 3.3σ /S , QL = 10σ /S S= the slope of the calibration curve of the response σ = the standard deviation(Residual Standard Deviation of a Regression Line or, the Standard Deviation of y-intercepts or, Standard Deviation of the Blanks)

강건성(Robustness) 실험 변수를 작지만 계획적으로 변화시켰을 때 분석법이 영향을 받지 않는 능력 견뢰성 (Ruggedness) 다양한 정상 시험 조건(표준 작업 방법서의 시험조건)에서 동일 검체를 분석하여 분석법이 환경(실험실간, 분석자간, 측정 장비간, 시약 롯트간, 시험일간, 시험 온도간)에 의해 영향을 받지 않고 재현되는 것을 말한다 -최소의 실험으로 최대의 정보를 얻기 위해 실험계획법을 사용 -분산분석법으로 평가

METHOD VALIDATION Ruggedness vs Intermediate Precision vs Reproducibilty Ruggedness Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P SITE 1 7.521 7.521 7.521 1.52 0.224 ANALYST 1 4.687 4.687 4.687 0.95 0.336 INSTRUME 1 28.521 28.521 28.521 5.77 0.021 REAGENT 1 2.521 2.521 2.521 0.51 0.479 DATE 2 4.042 4.042 2.021 0.41 0.667 Error 41 202.688 202.688 4.944 Total 47 249.979 Intermediate Precision Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P ANALYST 1 4.688 4.688 4.688 0.94 0.339 INSTRUME 1 28.521 28.521 28.521 5.70 0.022 DATE 2 4.042 4.042 2.021 0.40 0.670 Error 42 210.208 210.208 5.005 Total 47 249.979 Reproducibilty Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P SITE 1 7.521 7.521 7.521 1.43 0.238 Error 46 242.458 242.458 5.271 Total 47 249.979

Design of Experiment Characteristics Test No. Sample1) (μg/mL) Run2) Rep Analyst Date Other evaluation characteristics3) Specificity/Accuracy/Precision I 40/50/60 μg/mL (Protein BS) 1 3 Analyst I Day I Linearity4)/Range II Day II III Analyst II Robustness5) IV 50 μg/mL -

DOE for Robustness RUN 실험점 Factor 반복수 알카리성 동액 반응 시간 페놀 시액 반응 시간 1 A 10분 25분 3 2 B 35분 C 20분 4 D

Acceptance criteria Characteristic Acceptance criteria Analytical method Calculation method Specificity/ Accuracy 각 농도의 평균 회수율: 90 ~ 110% % Recovery Recovery(%)=(Conc. Of Spiking Sample - Conc. Of Unspiking Sample)/Conc. Of Spiking×100 Repeatability CV(%) ≤ 5.0% CV(%) CV(%)=(√V/Mean)×100 Intermediate Precision Robustness 전체 CV(%)≤ 5.0% 인자 유의성: Non-significant ANOVA Software 이용 Range 40 ~ 60 μg/mL NA 정확도,정밀도,직선성 만족 구간 Linearity R≥0.996 직선성:Significant Regression Analysis R, Software 이용