Western blot 생명과학 실험기법 (13주차)
11/23일 실험 개요 Western blot Cell harvest Cell lysis 단백질 정량 (Sampling)
실험 개요 Gel electrophoresis (SDS PAGE) Transfer Blocking Primary, secondary antibody incubation Developing (using film)
Sampling Introduction
Introduction SDS-PAGE
Introduction SDS-PAGE
Introduction Western blot
Introduction Transfer
Introduction Blocking 단백질의 Transfer 되지 않은 부분이 다른 단백질로 오염되거나 antibody가 붙을 수 없도록 Skim milk 나 BSA 등으로 Block 해주는 과정
Materials & Methods Sample preparation 샘플 단백질 정량 결과 SDS-PAGE OD (y값) 농도 (x값, μg/μl) X = (y-0.1245)/0.0376 A: 단백질 (30 μg) B: 5X dye C: DW 총부피 (A+B+C) C 0.245 3.2 μg/μl 9.4 μl 4 μl 5.6 μl 20 μl T 0.204 2.1 μg/μl 14.2 μl 1.8 μl e-tube에 계산한 양만큼의 A, B, C 를 넣어준다. Vortex, spindown Heat block에서 95℃, 10min
Materials & Methods Western blot Cassette 밑의 스티커를 제거하고 Gel tank에 넣은 후 고정시킨다 Running buffer를 채운다 Marker 7ul 와 준비한 sample을 20ul를 gel에 로딩한다 80V로 30분 running 120V로 1시간 30분 정도 running
Materials & Methods Transfer Transfer 준비 : tray에 transfer buffer, 작은 통에 메탄올, 3M paper 2개, PVDF 1장 (조 이름 기입), 핀셋 Cassette에서 gel을 꺼내 stacking gel과 밑 끝 부분을 제거한다 (Gel이 찢어지지 않도록 조심) -> tray로 옮긴다 PVDF(연필로 조 이름 기입)를 메탄올에 30초 담근 후 tray로 옮긴다 Transfer cassette - sponge - 3M paper - membrane – Gel - 3M paper sponge 순서로 쌓는다 Transfer tank에 buffer, 얼음팩, cassette를 넣고 100V로 1시간 transfer
CPT1 : 88kDa β-actin : 42kDa
Blocking Materials & Methods 5% skim milk in TBS-T 용액에 1시간 incubation