6장 대사산물의 생산 - 유기산발효 - 알코올발효 - 유기용매발효 - 아미노산발효 - 핵산발효 - 항생물질 - 생리활성물질 - 고분자물질발효 - 효소

6.2 알콜발효 6.2.1 총론 - 주정 : 85%이상, 무색투명 액체 - 생산 : 발효법과 합성법  발효법 (주류, 식품, 화장품 등)  당밀, 고구마, 타피오카 등  합성법 (공업용)  에틸렌 - 국내 주정  95% 6.2.1 총론 (1) 원리 - EMP  acetaldehyde  에탄올 C6H12O6  2C2H5OH + 2CO2 - 원료  전분  당화  발효 1kg 511g * 95% 수율  485g

6.2 알콜발효 - 포도당 100Kg  51.14 kg (64.3L) - 전분 100kg  56.82kg (71.5L) - 탄수화물의 5%정도  효모생육 및 부산물  95% 알코올 - 그 외 원료  fructose, Mannose, galactose 등 (발효성 당, zymohexose)  전분, 섬유질  직접 발효되지 않음 (2) 원료 - 당밀  발효성당  사탕수수 폐 당밀 - 전분, 섬유질  비발효성 당  고구마, 카사아버 등 - 국내 (쌀보리, 옥수수 등), 국외(황산펄프액)

6.2 알콜발효 1) 당질원료 ① 당밀 - 설탕제조부산물  사탕수수당밀, 사탕무당밀 - 정제당부산물  정제당 당밀, 전분당화액의 부산물 hydrosol  당분, 저가, 당화공정 x, 설비/작업이 간단 - 회분 50~40%로  K, Ca  증류탑 내 scale 부착의 원인 ② 아황산펠프액 - 비중 (1.10~1.16), 고형분(11-17%), 환원당(2.3~3.5%), 아황산(0.024~0.075%) 회분(1.6~2.5%), 리그닌(6.5~8.3%) - 구성당류  포도당 hexose(침엽수) xylose  pentose - 성분의 차이  목재종류, 증자조건에 차이

6.2 알콜발효 (2) 전분질 원료  시장유통 원료가격에 의존도가 높음 ① 곡류 : 쌀, 보리 밀, 귀리, 옥수수, 조 등 ① 곡류 : 쌀, 보리 밀, 귀리, 옥수수, 조 등 ② 고구마 : 전분, 전질소, 회분이 적당  아밀레이즈가 포함되어 있어 증자조건을 고려 ③ 타피오카 (3) 이눌린 원료 - 돼지감자의 구근에 함유  자체의 효소활용, ilulase, 산당화법을 이용 (4) 섬유질원료 - 목재, 폐농산물(짚, 겨, 고구마넝쿨)  당화법  산당화법, 효소당화법

6.2 알콜발효 6-2-2 각종 알코올 발효법 (1) 당밀로부터 알콜발효 1) 당밀의 전처리 - 증자  총당 10-12%(술덧용 15-17%)로 희석, pH 4.8-5.0, 발효조성제 첨가 - 발효조성제 (황산암모늄, 요소, 쌀겨  질소원)  원당밀 대비 황산암모늄(1%), 쌀겨(3%), 발효증류 폐액(20%) - 살균  100℃, 30분 또는 1kg/cm2 (121℃), 10분간 2) 술밑 (주모)제조 - Saccharomyces formosensis, S. robustus - 국즙한천 사면배지  동일 시험관배양 (당도 10%, 25~30℃, 24시간)  국즙 pasteur 배양(25~30℃, 14~24시간)  당밀희석액 carlsberg 관 (25~30℃, 24시간) 3) 발효 ① 밀폐식 발효 - 30~35℃, 48시간 - 잡균오염이 적고, 품온 조절이 용이, 휘발이 적음, - 수율증가 운전비용이 개방식보다 고가

6.2 알콜발효 ② 특수발효 - Urises de Melle 법(Reuse 법) - Hildebrandt-Erb 법(Two stage 법) - 고농도 술덧발효법 - 연속발효법

6.2 알콜발효 1. 고체국 : Aspergillus shirousamii 2. 액체국 : A. awamori var fumeus, A. niger, A usami 3 아밀로(Amylo) 국: Amylomyces rouxii (당화와 알콜발효를 동시진행) 4. 절충법 (당화는 액체와 고체국으로 그리고 술밑은 아밀로균으로 당화) - 아밀로 술밑 고체국절충법: 고체국 (Aspergillus oryzae) - 아밀로술밑 액체국 절충법,: 액체국 (A. awamori var fumeus , A. niger, A usami)

6.2 알콜발효 (2) 전분질 원료에서의 알코올 발효법 - 당화 (고체 제국법, 액체국법, 아밀로법, 아밀로 술밑 고체국절충법, 아밀로술밑 액체국 절충법, 맥아법, 산당화법 등) 1) 원료의 전처리 - 세척과 절단 - 분쇄(증자조건 향상, 균일성) 2) 증자 - 고온고압에서 가열  호화/살균 - 증자기 종류(그림 6-5) - 발효법에 의한 분류  아밀로법 술덧의 증자 (37℃, 아밀로균의 발아 및 효소생산)  국법/절충법의 술덧 (55~60℃, 코지첨가 ) - 증자 후 pH 4.6으로 조절 (증자 술덧의 점도저하, 잡균오염방지) - 증자조건  고구마, 2.0~2.5kg/cm2, 30~40분)  옥수수, 3.0 kg/cm2, 40~50분)

6.2 알콜발효 3) 국법에 의한 알콜발효 ① 밀기울 코지  밀기울:왕겨(6:4) 수분흡수  pH 4.4조절  증자(100℃, 1시간)  종국접종(A. shirousamii)  국실온도 (26~28℃, 40~50%  출국시 20-25%)

6.2 알콜발효 ② 술밑 - 증자술덧 밀기울 코지첨가  젖산균접종  45~48℃, 16~20시간 배양 pH 3.6~3.8  100℃, 30~60분간 살균 30~33℃ 냉각  효모를 접종  48시간 통기배양 ③ 당화 - 술덧  당화기로 이동  밀기울 코지첨가  당화(55-60℃, pH 4.8유지)  23~33℃로 냉각 후 발효탱크로 이동 ④ 발효 - 술밑을 10% 첨가  발효(초기 36℃) 48 시간후 온도 30℃로 유지  증식기 5~7일간  주발효(15시간)  후발효 30시간 소요 4) 액체국법에 의한 알코올발효 - 밀기울 코지대신 액체코지를 첨가  밀폐된 배양탱크를 이용 - 균주 (A. awamori var fumeus, A. niger, A usami) 고체배지에서 균주를 착상 - 배지 : 탄소원 (고구마, 옥수수, 수수, 전분박 등이 많이 사용), 질소원(밀기울, 쌀겨, 대두박 등), 탄소원과 질소원의 비율(10:0.6~1.0) pH 4.4~4.6조절 후 살균후 사용 - 배양 : air-lift 형 호기배양장치, 28~32℃에서 배양

6.2 알콜발효 5) Amylo 법에 의한 알코올발효 - Amylomyces rouxii (Mucor rouxii)를 이용 당화와 알콜발효를 동시 시도  이후 효모를 첨가하는 방법으로 개량 - 장점  코지를 만드는 시간과 노력이 전혀 필요 없음  밀폐발효로 효율이 높음  다량의 담금이라도 소량의 종균으로 가능  잡균의 오염이 없음 - 단점  곰팡이를 이용하므로 점도가 높아 감소를 위해 희석  당화가 길다

6.2 알콜발효 - 과정 그림 참조 : 증자액 + 질소원 등 첨가  amylo 균접종  발효(통기, 34~37℃, 30시간)  효모접종(30-33℃ 조절)  18-20시간 이후 균체증가 (공기소량 통기)  36-60시간, 발효의 최성기에 도달  90시간 정도 종료

6.2 알콜발효 6) 아밀로 술밑 국 절충법 - 술밑 (아밀로 술밑을 사용하여 당화) - 본배지의 당화 : 고체국인 밀기울 코지(A. oryzae)와 액체국(흑국균)을 이용 - 술밑과 국의 사용량 : 밑술의 당화력에 따라 국의 사용량에 차이 - 발효는 품온 30-33℃, 72-84시간, 단금농도 12-14%, 알코올분 6-8%

6.2 알콜발효 - 고구마 아밀로 술밑과 밀기울 코지(A. oryzae) - 고구마 아밀로 술밑과 액체국(A. awamori var fumeus)

6.2 알콜발효 7) 알코올의 제조비율 증자비율, 당화비율, 발효수율, 증류비율

6.2 알콜발효 8) 숙성 술덧의 성분 ① Acetaldehyde ② Diacetyl ③ Methanol ④ Fusel oil (3) 아황산 펄프폐액 및 섬유질원료로 부터 알코올발효 - 아황산펄프폐액 중에는 효모의 생육을 저해하는 아황산, 리그닌함유  제거, 중화처리  영양분첨가  발효 (4) 기타의 방법에 의한 알코올발효

6.2 알콜발효 6.2.3 증류 * 비등점 (끓는 점)  압력이 일정하였을 때 포화온도의 일종으로 물질마다 고유한 알코올과 물을 분리  95% 알코올 분으로 농축 (1) 증류이론 1) 알코올과 물 혼합액의 비등점과 조성 - 2종의 액체혼합물(물과 알코올)을 가열 비등 시킬 때 발생하는 증기는 원 액체보다 저 비점성분이 더 많아짐 즉, 증기에 비등점이 낮은 알코올 분이 더 많이 함유 - 주정과 물의 혼합물을 끊일 경우 그 액의 비점과 증기 중 주정 %를 표시 * 비등점 (끓는 점)  압력이 일정하였을 때 포화온도의 일종으로 물질마다 고유한 값을 갖고 있다.  특별한 경우가 아니면 비등점은 1기압에서의 상압비등점을 뜻한다. 일반적으로 압력이 높아짐에 따라 비등점도 상승한다.  알코올의 비등점: 78.17℃

6.2 알콜발효 < 표 1. 알코올ㆍ물 혼합액의 비등점 > - 증기에 비등점이 낮은 알코올 분이 더 많이 함유 (표 6-8) < 표 1. 알코올ㆍ물 혼합액의 비등점 >

6.2 알콜발효 2) 증발계수 - 액체중 주정의 %를 A로 하고 이 혼합액에서 발생한 증기중의 주정 %를 a로 하면 = 알코올ㆍ물 혼합액의 알코올 증발계수(Ka)로 표현 = 알코올 농도가 높을 수록 Ka는 적어진다. 3) 비등응축곡선 - 그림 6-8을 그림으로 나타내면 그림 6-9와 같다. - 알코올 10% 수용액  92.5℃에서 끊기 시작  냉각, 응축  알코올 51% 수용액, 비등점 82.℃  82℃에서 끊인 후 냉각응축  알코올 75%, 비등점 80℃  반복 - K점에 도달  97.2%(v/v) [95.57%(w/w)]의 알코올 분을 획득할 수 있다  비등점과 응축점이 78.15℃  공비점 (공비혼합물)

6.2 알콜발효 75 97.2% 80 82 92.5

6.2 알콜발효 4) 정류계수 - 증류원액 중에는 알코올과 물 이외에 알데히드, 에스테르, 고급알코올 등 이 함유 - 이들 불순물의 주정 수용액에 대한 증발계수는 성분에 따라 차이가 있어 주정증류와 깊은 관계가 있다. - Sorel 은 각종 주정 농도에 있어서 여러 가지 불순물의 증발계수를 측정하고 이것을 Kn으로 표시하였다. - 각 알코올 농도에 있어서 여러 불순물의 증발계수 Kn과 ka의 비  kn/Ka 를 정류계수라 한다. ① Kn/Ka =1 일 경우  비등시키더라도 알코올과 불순물의 비는 변하지 않는다.  증류하더라도 주정의 품질은 변하지 않는다.  증류후반기… ② Kn/Ka >1  증류하여 나오는 유액이 원액보다 불순물이 더 많아 진다.  곧 초류탑의 상부에서 나오는 초류물이 이에 해당한다.  증발초기에… ③ kn/Ka <1  ② 와 반대로 유출액이 원액보다 불순물이 적다  증발 중반기…..

6.2 알콜발효 (2) 증류장치 - 고형분과 비휘발성성분을 제거한 다음 물과 알코올이 함께 유출  휘발성의 차이를 이용하여  순수한 알코올을 제조하는 장치 1) 단식증류기 - 증기를 응축  알코올을 주성분으로 하는 액을 획득 - 술덧과 비 휘발성분만 제거 - 알데히드, 에테르, 퓨젤오일, 휘발산 등이 알코올 중에 남아  알코올 생산에는 이용하지 않음 - 소주, 위스키, 브랜디, 고량주 등의 증류에 이용 2) 연속식 증류기  대규모증류 - 증류탑과 응축기로 구성 - 불순물 제거장치인 가스분리기와 fusel oil 분리기가 부착

6.2 알콜발효 위스키 :  증류기 : pot whisky(단식증류), : patent whisky (두 개의 증류탑으로 구성된 연속증류기)  증류  초류  중류 (68-63%)  저장/숙성 patent whisky pot whisky

6.2 알콜발효 ① 술덧 중의 고형물이나 수용성의 비휘발성 성분 등을 술덧 탑에서 제거 ② 발생하는 증기  알코올보다 휘발하기 쉬운 탄산가스, 알데히드 등 저비점 성분분리  초류탑과 추출탑 ③ 정류탑에서 알코올을 농축 ④ 알코올농도 42-43% 전후에서 농축되는 fusel oil 분리 ⑤ 혼합액에 물을 첨가하여 10%내외로 하여 재증류  휘발성 불순물을 제거 - 이와 같이 비등과 응축을 반복  알코올을 농축 , 불순물을 제거 - guillaume 식, grinmar 식, allospas 식 등이 있다.

6-3. 유기용매발효 미생물 - ethanol, Butanol, Propanol, Acetone, Glycerol 등 발효산물  음료용 및 공업용  1. 아세톤과 부탄올 발효 - Butanol 발효의 기초  1861년 파스퇴르  1910년 Fernbach - 1차 세계대전 이전 Clostridium acetobutylicum에 의한 혐기발효  Weizmann 확립     Acetone  폭약의 원료     부탄올  고무의 원료인 butadiene제조   - 발효법에서는 단일생성물이 아닌 복합생성물 생산   - 3가지 유형       1) 아세톤-부탄올(C. acetobutylicum)      2) 부탄올-isopropan (C. butylicum)      3) 부티르산-초산발효 (C. butylicum)

6-3. 유기용매발효 가. 원료 및 원료처리 - 아세톤-부탄올  전분질/당질  EMP  pyruvate를 통하여 생산   가. 원료 및 원료처리     - 아세톤-부탄올  전분질/당질  EMP  pyruvate를 통하여 생산     - 에탄올 + butyric acid, CO2, H2 등 부생(그림 6-10)     - 아세톤-부탄올 발효       올바른 균주의 선택/발효조건의 조절         에탄올 등 원하지 않는 부산물의 생성을 억제        - 원료  감자, 옥수수, 고구마, 전분박, 폐당밀, 고농도당밀을 사용         기질농도(7%, 최대 10%)         전분질원료  분쇄, 살수, 교반, 고압을 통하여 증자         인산염과 질소원을 첨가 후 살균  나. 생산공정     - 전분질(옥수수) - C. acetobutylicum     - 폐당밀 - C. saccharoacetobutylicum     - 전분   - C. butylicum              - 발효는 완전밀폐식 탱크가 이용 (CO2를 공급하여 혐기성조절)     - 온도(34℃), pH(5.8~6.0), 혐기적으로 40~70시간배양     - 부탄올:아세톤:에탄올 = 6:3:1의 비율로 생성     - 연속증류와 분류에 의해 회수

6-3. 유기용매발효 C. acetobutylicum C. butylicum C. butylicum

6-3. 유기용매발효 2. 글리세롤 발효 - 폭약의 생산원료  Pasteur (1858) 알코올 발효과정 중 생성    - 폭약의 생산원료       Pasteur (1858) 알코올 발효과정 중 생성        Weuberg & Reinfurth(1918)  아황산염 존재시 생산됨을 증명      - 화장품, 의약, 음료 등에 이용        유지의 가수분해, 유기합성 등에 의해서도 생산  가. 글리세롤의 생성기작    - 3가지 발효형식 (Neuberg, 1919) 효모에서 일어나는 발효형식         1) C6H12O6  2C2H5OH + 2CO2 (정상적인 알콜발효- Gay-Lussac 발효식)     2) C6H12O6  C3H5(OH)3 + CH3CHO +CO2       : 아황산첨가, pH 5~6 (아세트알데히드의 환원을 저해 글리세롤이 생성)     3) C6H12O6  2C3H5(OH)3 + CH3COOH +CO2 + C2H5OH         pH 8.0 이상 

6-3. 유기용매발효 - Pyruvate  acetaldehyde  알콜   -  아황산염 첨가  알데하이드가 아황산 복합체 형성에 의해 제거되면  Glycerol-3-P 생성  인산가수분해효소에 의해 인산이 제거                               glycerol 이 생성   나. 글리세롤 제조    상기 1형) S. rouxii, Torulopsis magnoliae, Pichia farinosa Dunaliella salina(조류)  세포질 내에 합성          2형) S. cerevisiae (아황산 내영성) 당으로부터 50%가까이 생성  실질적 수율 20~30%                아황산염의 농도 0.1~0.5% 첨가 시 생성