Western blot
11/17일 실험 개요 Western blot Cell harvest Cell lysis 단백질 정량 (Sampling)
실험 개요 Gel electrophoresis (SDS PAGE) Transfer Blocking Primary, secondary antibody incubation Developing (using film)
Sampling Introduction
Introduction SDS-PAGE
Introduction SDS-PAGE
Introduction Western blot
Introduction Transfer
Introduction Blocking 단백질의 Transfer 되지 않은 부분이 다른 단백질로 오염되거나 antibody가 붙을 수 없도록 Skim milk 나 BSA 등으로 Block 해주는 과정
Materials & Methods Western blot 표를 보고 loadin할 gel을 만든다 Running Gel 10% gel 10ml H2O 4.0 30% acrylamide mix 3.3 1.5 M Tris (pH8.8) 2.5 10% SDS 0.1 10% ammonium persulfate TEMED 0.006 1)15ml tube에 각 각 Running Gel와 Stacking Gel을 만든다. (Stacking gel에는 TEMED를 넣지 말 것!) 2)cassette에 Running Gel을 l넣는다. 3)Gel이 중화되면 Stacking Gel에 TEMED를 넣고 cassette에 넣는다. 4) Comb을 조심히 넣고 중화시킨다. (loading 할 위치를 표시해준다) Stacking Gel 10% gel 4ml H2O 2.7 30% acrylamide mix 0.67 1.5 M Tris (pH6.8) 0.5 10% SDS 0.04 10% ammonium persulfate TEMED 0.004 <!>TEMED를 넣으면 굳기 시작하기 때문에 마지막에 넣을것! <!>TEMED를 넣고 나서 빠르게 cassette에 넣어주기.
Materials & Methods Western blot Comb을 양쪽 끝을 잡고 흐트러지지 않게 제거한 후 물로 세척 Cassette 밑의 스티커를 제거하고 Gel tank에 넣은 후 고정시킨다 Running buffer를 채운다 Marker와 이전시간에 준비한 sample을 gel에 로딩한다 80V로 30분 running 120V로 1시간 30분 정도 running
Materials & Methods Transfer Transfer 준비 : tray에 transfer buffer, 작은 통에 메탄올, 3M paper 2개, PVDF 1장 (조 이름 기입), 핀셋 Cassette에서 gel을 꺼내 stacking gel과 밑 끝 부분을 제거한다 (Gel이 찢어지지 않도록 조심) -> tray로 옮긴다 PVDF를 메탄올에 30초 담근 후 tray로 옮긴다 Transfer cassette - sponge - 3M paper - membrane – Gel - 3M paper sponge 순서로 쌓는다 Transfer tank에 buffer, 얼음팩, cassette를 넣고 100V로 1시간 transfer 5% skim milk in TBS-T 용액에 1시간 incubation
Report 12+13+14 12/7 5시 까지 제출