9장. Western Blot Analysis using His-Tag Antibody

Blotting(블러팅) 1) Southern blotting DNA분자를 아가로오스 겔(agrose gel)로부터 membrane으로 옮긴 후, 특정 DNA서열(sequence)을 probe(탐침)을 이용하여 탐지하는 방법. 2) Northern blotting Southern blotting과 같은 원리이며 DNA 대신 특정한 RNA를 탐지하는 방법.

Blotting(블러팅) 3) Western blotting Immunoblotting(면역블러팅)이라고 하기도 하며 항원-항체 반응을 이용하 여 여러 단백질 혼합물 중에서 원하는 특정 단백질만을 찾아내는 방법. 원하는 단백질에 대해서 높은 특이성을 가진 항체(high-quality antibody)가 필요하다.

항체를 이용한 다른 실험들 1) Western blotting 2) 면역조직화학(Immunohistochemistry) 3) 효소결합면역흡수분석법(ELISA-Enzyme Linked Immunosorbent Assay) 4) 면역퍼옥시다제 세포 염색법(Immunoperoxidase cell staining) 5) 면역형광 세포 염색법(Immunofluorescnce cell staining) 6) 면역침강법(Immunoprecipitation) 7) 유세포분석기(Flow cytometry)

Western blotting의 원리 전기적으로 분리된 단백질을 membrane으로 transfer하여 확인하는 방 법으로 주로 단백질이 갖고 있는 antigenic epitope와 특이하게 반응하 는 항체를 이용. 방사선동위원소로 표지되지(radiolabelled) 않은 복잡한 형태의 단백질 중에 특이한 단백질을 확인하고 정량하는데 유용. 장점 특정 단백질의 항원성을 통 해 확인가능. 단백질의 분자량 확인 가능. 소량의 단백질도 확인 가능. 2) 일반적인 blotting 실험 방법 시료(sample)준비 겔 전기영동(gel eletrophoresis) transfer to membrane blocking 항체부착 detection(검출)

Western blotting의 원리

Western blotting의 원리 3) Transfer 폴리아크릴아미드 겔(polyacrylamide gel)에서 단백질을(겔에서 분리된 그 대로) membrane으로 옮기는 과정. *Transfer buffer 20% 메탄올(methanol) : membrane에 단백질 결합능력(binding capacity)이 증가. *Membrane을 사용하는 이유? 항체를 이용하여 확인할 때 더 편리하다. 겔을 다루는 것 보다 편리하다. 염색(staining/destaining)이 빠르다. 장기간 보관에 용이하다.

Western blotting의 원리 *Transfer membrane의 종류 및 특징

Western blotting의 원리 4) Blocking Membrane상에서 항체와 단백질의 비특이적 결합(non-specific binding)을 피하기 위함. *Common membrane blocking reagents 5) Wash Western blotting은 여러 가지 연속적인 과정을 거치는데 이 때 비특이적 결합을 최소화해 주기위한 과정이다. Reagent Formulation Comments Dried milk 5 % non-fat dried milk in PBS or TBS Masks some antigens Milk/Tween-20 5 % non-fat dried milk in PBS or TBS, 0.1 % Tween-20 Tween-20 0.1 % Tween-20, 0.02 % NaN3 in PBS or TBS Can stain after detection BSA 0.3–3 % bovine serum albumin, 0.02% NaN3 in PBS Lower endogenous cross-reactivity

Western blotting의 원리 직접방법 (Direct method) 간접방법 (Indirect method) 장점 단점 -1가지 항체만 이용하므로 빠름. -2차 항체의 교차반응 (cross- reactivity)를 고려하지 않아도 됨. -1차항체에 대한 표지(label)가 이중으로 가능. -표지물질(label)을 1차 항체에 결합시 항체의 면역반응(immunoreactivity)감소. -가격이 비경제적. -신호(signal)가 거의 증폭되지 않음. -1차 항체 표지물질의 선택폭이 적음. 간접방법 (Indirect method) -2차 항체가 신호를 증폭시킴. -여러 종류로 표지된 2차 항체를 이용할 수 있음. -한 종류의 2차 항체를 여러 종류의 1차 항체에 이용가능. -표지능(labeling)이 1차항체의 면역반응(immunoreactivity)에 영향을 끼치지 않음. -2차 항체에 따라 발현방법(detection method)을 다르게 할 수 있음. -2차 항체는 비특이적 염색(nonspecific staining)이 나타날 수 있음. -직접방법보다 추가적인 단계가 있음.

Western blotting의 원리 *항체 –항원과 결합하는 단백질을 말하며, 혈액과 체액에 녹아있는immunoglobulin (Ig)을 지칭. (단일클론항체, 다클론항체) *1차 항체(primary antibody) Membrane에 붙어있는 단백질 중에 확인하고자 하는 단백질의 항원을 인식하므 로 항원 특정 부위에 결합. 적절한 희석이 중요 - 원하는 단백질을 특이적으로 확인 할 수 있으며 비특이적 결합은 최소화하는 범위. *2차 항체(secondary antibody) 1차 항체를 인식하여 결합. 1차 항체에 대하여 종(species) 특이적으로 준 비. e.g) rabbit 1차항체 -> goat-anti rabbit 2차 항체 일반적으로 HRP(horseradish peroxidase)나 AP(alkaline phosphatase)같은 reporter enzyme을 포함.

*항체 표기방법 1.Host : antibody를 어디서 만들었는가. Antibody가 생산된 동물. 2.Anti-Target gene 3.Ig type 4.conjugate name(옵션 - 보통 2차항체 있음) 1차 항체를 표기하는 방법 ex) 마우스에서 만든 actin을 잡는 항체 중 IgG type = Mouse anti-actin IgG 2차 항체를 표기하는 방법 ex) 염소에서 만든 항체 중 mouse actin을 잡는 IgG type인데 HRP conjugation = Goat anti-mouse actin IgG (HRP)

발색(Chromogenic, Colorimetric) 화학발광(Chemiluminescent) Western blotting의 원리 *확인방법(Detection method) 발색(Chromogenic, Colorimetric) repoter enzyme 기질(substrate) 반응결과 HRP (Horseradish peroxidase) DAB(3,3'-diaminobenzidine) 갈색. (니켈(Ni)이나 코발트(Co)이온 첨가시 민감도가 상승) TMB(3,3'5,5' tetramethylbenzidine) 청색 4CN(: 4-chloro-1-naphtol) 청색/흑색 AP (Alkaline phosphatase) BCIP/NBT(5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/nitroblue tetrazolium) 화학발광(Chemiluminescent) Luminol light, glow or flash Dioxetene-phosphate light, glow

Western blotting의 원리 발색법: 신호가 착색된 침전물형태로 형성. 화학발광법: 반응결과 빛을 방출. BCIP는 AP에 의해 가수분해되어 인디고 염색(indigo dye)을 만드는 이합체화 반응 (dimerization)을 하는 중간체 (intermediate)를 형성한다. NBT는 이합체화 반응에 의해서 산화되어 NBT-formazan으로 바뀐다.

전기영동과 transfer(NC membrane 이용) 1. Electrophoresis - SDS-PAGE gel (10 %) - 1X SDS PAGE buffer (25 mM Tris-base, 1.92 M glycine, 0.1 % (w/v) SDS) 2. Transfer - Transfer buffer (23 mM Tris-base, 189 mM glycine, 20 % Methanol) - NC membrane (1) SDS-폴리아크릴아미드 겔(10%)을 틀에 굳혀서 만든다. (2) Gel caster에서 겔을 떼어낸 다음 tank에 장착하고 buffer를 채운다. (3) 시료를 loading을 한 다음 dye가 바닥에 올 때까지 전기영동한다. (4) Membrane, 종이를 스폰지 크기에 맞게 미리 자른 후 transfer buffer에 담가둔다. (5) Transfer sandwich 만든다. (-) 스폰지/ 종이/ 겔/ membrane/ 종이/ 스폰지 (+) (6) Transfer tank에 장착하고 transfer한다. : 80V, 300mA, 150분

확인(NBT/BCIP 이용) 3. Blocking - Blocking buffer (3 % (w/v) non-fat dried milk in TBST) 4. Binding of 1st Antibody - Primary antibody in 1% non-fat dried milk (1:500 dilution) in TBST 5. Binding of 2nd Antibody - Secondary antibody in 1% non-fat dried milk (1:2000 dilution) in TBST 6. Washing - TBST (150 mM NaCl, 50 mM Tris-Cl (pH 8.0), 0.1% Tween 20) (1) Blocking- 3% non-fat dried milk in TBST 5ml에 membrane을 담가두고 rocker에 30분, RT(상온). (2) 1차항체 처리/TBST- 1% non-fat dried milk in TBST 5ml에 His-Ab 10μl (1:500)를 넣은 후 rocker에 30분, RT(상온). (3) Washing- 1차항체를 버리고 rocker위에서 TBST 5ml로 5분간 3번. (4) 2차항체 처리/TBST- wash하는 TBST를 버리고 1% non-fat dried milk in TBST 5ml 에 anti-mouse-AP가 달린 2차항체를 2.5μl(1:2000)를 넣은 후, rocker에 30분, RT(상 온). (5) Washing- 2차항체를 버리고 rocker위에서 TBST 5ml로 5분간 3번. (6) 확인(AP 염색)- NBT/BCIP 용액 10ml을 바로 membrane에 붓고 밴드(band)가 나타 날 때 까지 rocking. (7) 발색되는 밴드를 확인한 후에 5ml TBST로 씻어준다.

실험결과 CBB staining WB ECL NBT/BCIP His-p53 His-p53 pCDNA Lysate pCDNA Pre-stained Protein size marker CBB staining WB His-p53 pCDNA His-p53 Lysate Lysate pCDNA ECL NBT/BCIP

Further Study (1) 항체를 이용한 실험들- 원리 및 이용 정리 (실험 당 5줄 이내) 면역조직화학(Immunohistochemistry) 효소결합면역흡수분석법(ELISA-Enzyme Linked Immunosorbent Assay) 면역형광 세포 염색법(Immunofluorescnce cell staining) 면역침강법(Immunoprecipitation) (2) Western blotting 실험시 1차항체:rabbit anti-GFP, 2차항체:goat anti- Lamin-HRP를 사용하였다면 host(각 항체의), anti-Target gene, conjugate reporter enzyme을 쓰시오. (3) Monoclonal 항체와 polyclonal 항체의 특징과 차이점을 설명하시오.(5줄 이내)

다음주 수업 전까지(4시까지) 과S338호 앞 바구니 보고서는 손글씨로 작성합니다. 인터넷 등 각종 자료를 그대로 복사하는 경우 감점합니다 자료 인용 시 반드시 Reference를 씁니다 본인의 학번과 이름을 반드시 기재합니다 미제출시 0점 처리합니다 기타 수업 및 레포트 관련 문의는 tiffanyohk@naver.com (S338, 02-2123-7612) 보고서 제출 다음주 수업 전까지(4시까지) 과S338호 앞 바구니 늦게 제출시 감점!!